傳統泡菜中乳酸菌的篩選鑒定及抗氧化特性分析

趙鑫，胡蝶，張素平，祁勇剛,3，吳勇超，高冰,3，柳志杰,3*

(1.湖北工業大學生物工程與食品學院 湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068；2.湖北聚匯農業開發有限公司，湖北 荊門 431821；3.湖北省發酵蔬菜企校聯合創新中心，湖北 荊門 431821)

泡菜歷史悠久，從古至今在中國人的食譜中扮演了重要的角色。其由大白菜等生鮮蔬菜與中，低濃度鹽水浸泡腌制，經乳酸菌為主的益生菌發酵，形成獨特風味的腌漬食品[1-2]。因其酸咸適中、清香脆嫩、色澤誘人且富含有機酸、維生素、氨基酸等成分，獲得了世界各地人們的喜愛[3-4]。隨著食品工業的發展，對泡菜的研究愈發廣泛，如篩選應用發酵劑[5-6]、優化發酵工藝[7-8]、分析香味成分等[9]。近幾年來，篩選出耐酸且兼具有益屬性的乳酸菌作為天然發酵劑已成為研究熱點。研究表明，一些乳酸菌具有清除活性氧，緩解氧化損失的作用[10]。羅強等[11]從20份自然發酵泡菜中篩選得到植物乳桿菌NR-11和LR-13、棒狀乳桿菌LR-43對人工模擬胃液有較強的耐受性，具有腸胃益生菌的潛力。梁小波等將分離篩選獲得的高抗氧化活性發酵乳桿菌ZN011接種發酵泡菜，縮短了2 d左右的發酵周期，改善了風味。

本實驗從傳統發酵泡菜中分離純化得到2株疑似乳酸菌，對其進行分子生物學鑒定，分析產酸、耐酸及抗氧化活性等生物學特性，以期為具有耐酸、較高抗氧化能力的乳酸菌制劑及在發酵食品中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

泡菜：采用傳統方法制作發酵而成，取自湖北聚匯農業開發有限公司泡菜車間，用無菌袋收集，于4 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 MRS液體培養基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L。

1.1.2.2 MRS固體培養基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，瓊脂粉15.0 g/L。

1.1.2.3 MRS鑒定培養基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，碳酸鈣0.02 g/L。

1.1.3 主要試劑

2×Taq Master Mix試劑(試劑中含有染料)：購于天根生化科技(北京)有限公司；細菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)：均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵(FeSO4)、水楊酸(C7H6O3)、過氧化氫(H2O2)、二乙三胺五乙酸(C14H23N3O10)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、聯苯三酚(C6H6O3)、磷酸緩沖液(PBS)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、三氯乙酸(Cl3CCOOH)、三氯化鐵(FeCl3)：均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設備

AR323CN 電子天平 奧豪斯儀器有限公司；ME54E微量天平、DELTA320 pH計 梅特勒-托利多有限公司；DK-S22恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；5424R臺式高速冷凍離心機 Eppendorf公司；CR21N落地式高速冷凍離心機 日本Hitachl公司；MS-H-ProT磁力攪拌器(大龍)；HCB-1300V垂直層流超凈工作臺(海爾)；MLS-3781L高壓蒸汽滅菌鍋 日本Panasonic公司；ZXSR-1270恒溫培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；DYY7C電泳儀 北京市六一儀器廠；TC-96/G/H(b)C PCR儀 杭州博日科技有限公司；95-0444-01凝膠成像儀 上海苑勝儀器設備有限公司；UV-1601 UV-Vis分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

取泡菜發酵液樣品1 mL，無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，取各梯度100 μL均勻涂布于MRS鑒定培養基上，貼封口膜置于37 ℃的恒溫箱中培養48 h。觀察菌落形態并挑選產生溶鈣圈的菌種，在MRS固體平板上純化直至出現單菌落[12-13]。對篩選的單一菌進行生理生化實驗[14]，保存備用。

1.2.2 乳酸菌的16S rDNA鑒定

PCR擴增體系(50 μL)：25 μL 2×PCR預混液，1 μL菌液作為模板，2.5 μL引物27F，2.5 μL引物1492R，19 μL ddH2O。

PCR擴增條件：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30次循環，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保溫備用。

PCR擴增產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將測序結果提交至NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行Blast同源性比對，選取同源性較高的模式菌株16S rDNA序列，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法(neighbor joining，NJ)構建系統發育樹。

1.2.3 乳酸菌產酸能力測定

取分離純化的200 μL菌液接種至10 mL MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，4000 r/min離心10 min，棄上清液，無菌水重懸調整菌液濃度為1×108CFU/mL(OD595 nm=1.0)。37 ℃培養0，4，8，16，20，24 h，測定發酵液的乳酸量[15]。

1.2.4 乳酸菌耐酸能力測定

用鹽酸調節液體培養基至不同的pH(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)。吸取1 mL菌液接種至上述不同pH的培養基中，37 ℃恒溫培養24 h，測定OD600 nm。

1.2.5 乳酸菌抗氧化性測定

1.2.5.1 制備乳酸菌細胞懸浮液和無細胞提取物

細胞懸浮液制備：取活化3代后的菌液，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用無菌水洗滌3次，重懸調整菌液濃度為1×108CFU/mL(OD595nm=1.0)。

無細胞提取物制備：對細胞懸浮液進行離心破碎處理，電鏡檢查無完整細胞，離心收集上清液。

1.2.5.2 DPPH清除能力測定

參考Lin等[16]的方法并略作改進：取樣品各2 mL，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液，充分混合并避光反應30 min，9000 r/min離心10 min，取上清液在OD517 nm處測吸光度。按式(1)計算DPPH自由基清除能力。

DPPH清除能力(%)=[1-(A1-A10)/A0]×100%。

式(1)

式中：A1為樣品和DPPH-無水乙醇的吸光度；A10為無水乙醇代替DPPH-無水乙醇的吸光度；A0為同體積純水代替樣品的吸光度。

1.2.5.3 羥基自由基清除能力測定

參考He等[17]的方法并略作改進：取樣品2 mL加入5 mmol/L硫酸亞鐵溶液、5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、3 mmol/L H2O2各1 mL，37 ℃水浴20 min，測定OD510 nm。按式(2)計算羥基自由基的清除能力。

羥基自由基清除能力(%)=[1-(A1-A10)/A0]×100%。

式(2)

式中：A1為樣品組的吸光度；A10為同體積純水代替H2O2溶液的吸光度；A0為同體積純水代替樣品的吸光度。

1.2.5.4 超氧陰離子清除能力測定

參考張江巍等[18]的方法：取樣品0.5 mL加入150 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.2)、1.2 mmol/L鄰苯三酚溶液、3 mmol/L二乙三胺五乙酸溶液各1 mL。25 ℃水浴10 min，測定OD325 nm。按式(3)計算超氧陰離子的清除能力。

超氧陰離子清除能力(%)=[1-(A11-A10)/(A01-A00)]×100%。

式(3)

式中：A11為含樣品和鄰苯三酚的吸光度；A10為含樣品，不含鄰苯三酚的吸光度；A01為不含樣品，含鄰苯三酚的吸光度；A00為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度。

1.2.5.5 還原能力測定

參考劉洋等[19]的方法：取樣品0.5 mL加入0.2 mol/L PBS溶液(pH 6.6)、1%鐵氰化鉀溶液各0.5 mL混勻，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸0.5 mL，4000 r/min離心5 min，取上清液、蒸餾水、0.1%三氯乙酸各1 mL混勻，靜置反應10 min，測定OD700 nm。按式(4)計算還原能力。

還原能力(%)=(A1-A0)/A0×100%。

式(4)

式中：A1為樣品組的吸光度；A0為PBS緩沖液代替樣品的吸光度。

1.3 數據分析

使用NCBI數據庫對比菌株的相似性，MEGA 7.0繪制系統發育樹，Origin 2019進行數據分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的生理生化實驗

從泡菜發酵液中共分離出2株乳酸菌，將其命名為Z2、Z5。生理生化實驗見表1，2株菌均為G+，過氧化氫酶、明膠液化、產硫化氫、吲哚實驗均為陰性。

表1 乳酸菌的生理生化實驗

2.2 乳酸菌的16S rDNA鑒定

采用試劑盒提取2株菌的DNA，PCR擴增后電泳，結果見圖1。

圖1 乳酸菌PCR產物電泳圖Fig.1 PCR product electrophoretogram of lactic acid bacteria

由圖1可知，對菌株DNA采取16S rDNA PCR擴增后，均得到條帶大小在1000～2000 bp左右的產物，表明PCR擴增產物無雜質可進行測序，符合預期長度。將測序得到的結果提交到NCBI進行Blast同源性比對搜索，結果見表2。Z2與Limosilactobacillusfermentum的相似度為99.05%，Z5與Lactiplantibacilluspingfangensis的相似度為99.16%。

表2 乳酸菌16S rDNA序列鑒定結果Table 2 The identification results of 16S rDNA sequence of lactic acid bacteria

采用MEGA 6.0軟件分析，鄰接法構建系統發育樹，Bootstrap自展1000次檢驗進化樹拓撲結構置信區間，結果見圖2。菌株Z2與發酵乳桿菌聚為一支，菌株Z5與植物乳桿菌聚為一支，親緣關系較近。

圖2 基于16S rDNA序列的乳酸菌系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequence

2.3 乳酸菌的產酸能力

產酸力是乳酸菌的重要特性之一。對獲得的2株乳酸菌在37 ℃培養24 h進行產酸能力測定，結果見圖3。

由圖3可知，發酵24 h時，相對于發酵乳桿菌Z2，植物乳桿菌Z5的菌液pH明顯較低，酸度高，產酸能力明顯較強。在0～20 h內，2株菌的產酸量都在逐漸增加，20～24 h內，產酸量逐漸趨于平緩或下降。其中，菌株Z5的產酸速度最快，產酸量最高，達到1.393 g/L。這與趙山山等[20]從貴州泡菜中分離出的植物乳桿菌產酸量結果相近。

2.4 乳酸菌的耐酸能力

對2株乳酸菌的耐酸能力進行測定，結果見圖4。

圖4 乳酸菌的耐酸性Fig.4 The acid tolerance ability of lactic acid bacteria

由圖4可知，隨著培養基酸度的增強，2株乳酸菌的生長都受到抑制。在pH值<5.0時，菌體濃度下降幅度大，在pH值為4.0時，2株菌的生長差異最為明顯，Z5的耐酸能力最強。

2.5 乳酸菌的抗氧化性

圖5 菌株對DPPH自由基的清除能力(a)、羥基自由基的清除能力(b)、超氧陰離子的清除能力(c)、還原能力的測定(d)

2.5.1 清除DPPH自由基能力的測定

由圖5中a可知，菌株的完整細胞懸浮液對DPPH自由基的清除率平均在(50.615±0.329)%，最高的為Z2，清除率達到(59.294±0.294)%。菌株的無細胞提取物的清除率平均在(33.180±0.580)%，最高的為Z2，清除率達到(41.990±0.364)%。乳酸菌的細胞懸浮液和無細胞提取物的清除能力也有所差異，細胞懸浮液的清除能力均高于無細胞提取物。Z2對DPPH自由基的清除能力最高，即抗氧化性最高。

2.5.2 清除羥基自由基能力的測定

由圖5中b可知，兩株乳酸菌的無細胞提取物和細胞懸浮液都表現出一定的羥基自由基清除能力，但清除能力有所差異。Z2的細胞懸浮液清除效果最強，清除率達到(52.244±0.311)%。Z5的無細胞提取物清除能力較強于Z2，清除率達到(37.944±0.794)%。

2.5.3 超氧陰離子清除能力的測定

由圖5中c可知，細胞懸浮液對超氧陰離子的平均清除率為(10.912±0.589)%，其中Z2的清除率最高，達到(11.370±0.492)%。無細胞提取物的平均清除率為(6.901±0.507)%，Z2的清除率最高，可達(8.510±0.689)%。總體看來，Z2對超氧陰離子的清除能力較高于Z5，細胞懸浮液的清除能力較高于無細胞提取物，這與郭慧芬等[21]的研究結果一致。

2.5.4 還原能力的測定

由圖5中d可知，2株乳酸菌的還原能力均有一定的差異，細胞懸浮液的還原能力均高于無細胞提取物，Z2的細胞懸浮液還原能力較高，達到(13.518±0.660)%， Z5細胞懸浮液的還原能力為(13.181±0.299)%，Z5無細胞提取物的還原能力高于Z2，達到(10.794±1.174)%。

3 結論

實驗從泡菜中分離出2株菌，經生理生化實驗及16S rDNA序列對比，鑒定Z2為發酵乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)，Z5為植物乳桿菌(Lactiplantibacilluspingfangensis)。通過對菌株產乳酸量、鹽酸耐受性進行分析，發現2株菌的性質較為優良，其中Z5的乳酸量達到(1.393±0.060) g/L，耐酸能力最強，可在pH 2.0的條件下存活，是可進一步研究與應用的備選菌株。測定2株菌的體外抗氧化能力，比較發現，細胞懸浮液對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除率以及還原能力都明顯高于無細胞提取物，其中Z2的抗氧化活性強于Z5，還原能力大于13%，為具有耐酸、較高抗氧化能力的乳酸菌制劑及在發酵食品中的應用提供了理論參考。