中國傳統發酵食品微生物多樣性研究進展

陳鏡如，邊鑫,楊楊,邢童林，王子軒，任麗琨，胡良術，何林陽，張娜

(哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江省谷物食品與綜合加工重點實驗室，黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

發酵是一種用于改善食品品質和長期保存食品的加工手段[1]。傳統發酵食品通常憑借自然野生菌落發酵為主要生產方式。在進行發酵時通常會引入來自于原料和環境的多種微生物，而這些微生物可利用原料中的營養成分通過三大代謝途徑——糖、脂肪和蛋白質代謝改變食物本身的質地及食用品質，產生獨特的發酵香氣[2]。在我國幾千年的歷史進程中，開發了原料多樣、工藝復雜、種類繁多的傳統發酵食品如發酵酒、酸菜、大醬、臘肉等，構成了我國飲食文化重要的組成部分。由于在自然發酵的過程中微生物種類和豐度存在差異，而且常伴有有害菌或致病菌的引入，這會嚴重影響傳統發酵食品的感官品質、風味和食用安全性[3]。因此，揭示傳統發酵食品的微生物多樣性，探究菌群結構和發酵過程中的核心微生物對科學安全地制作、調控發酵食品有著重要的指導作用，為傳統食品的發酵過程工業化、規模化、穩定安全化提供了理論基礎。本文重點綜述了現代高通量檢測方法，對中國傳統發酵食品中微生物特殊的多樣性結構和主要核心作用微生物、中國傳統發酵食品的前景導向進行了展望，為傳統發酵食品的加工工藝改良和品質調控提供了理論基礎。

1 中國傳統發酵食品微生物多樣性研究方法

由于傳統發酵食品生產方式所涉及到的微生物來源廣、種類多、演替演化規律復雜，僅單純依靠傳統人工分離方法不能滿足當下人們對傳統發酵食品中復雜微生物系統的了解。近些年，隨著分子生物技術的不斷發展，新一代測序技術正逐漸取代傳統培養方法，廣泛應用于微生物多樣性的分析。這些新一代測序技術一類是擴增子測序，例如一代測序：變性梯度凝膠電泳技術(PCR-DGGE)；二代高通量測序：16S rDNA、ITS測序等;三代測序：16S rDNA全長、宏基因組技術，其優勢在于可以對每一條獨立的DNA分子進行測序，從而分析得到微生物的物種注釋及代謝通路信息。這些技術在發酵酒肉制品、谷物食品等鑒定中都有廣泛的應用[4]。

1.1 PCR-DGGE技術

傳統的平板分離培養方法過度依賴人工的操作及菌體的生長，實驗周期長，不確定性大。PCR-DGGE技術避開了傳統檢測方法的弊端，采用特異性PCR擴增從樣本中提取出來的基因組DNA，在DGGE技術有效分離和快速鑒定后將擴增產物進行分析從而獲取到樣品中菌群圖譜[5]。燕平梅等利用PCR-DGGE技術在不同品種酸菜樣品中檢測到8種微生物，而散裝酸菜的微生物多樣性更為豐富，同時，在經16S rDNA測定后，發現乳酸菌屬為酸菜中的核心微生物[6]。與傳統的測序方法對比，PCR-DGGE技術在對傳統方法未能培養出來的菌株進行鑒定時，用時更短，準確度更高，并可對大量樣本同時進行測序工作，是研究發酵食品微生物群落結構最常用的分子生物技術之一[7]。但該技術具有一定的局限性，當對復雜的生態系統進行研究時，對豐度較低(低于1%)的微生物無法檢測出來[8]。

1.2 高通量測序技術

高通量測序技術是基于高通量測序平臺檢測特定環境下的微生物，并結合生物與信息學來分析樣本中各種微生物物種種類、物種豐度、種群結構、系統演變等相關信息。根據細菌和真菌間的序列差異，高通量測序可以化分為16S rDNA、18S rDNA和ITS測序。16S rDNA主要進行原核微生物的物種鑒定，而18S rDNA和ITS測序主要用于真核微生物的鑒定。不同測定方法的檢測區域及主要目的見表1[9]。

表1 不同微生物多樣性測序方法功能對比

相比PCR-DGGE技術，高通量測序通過獲得大量測序結果數據，能夠對豐度低于0.0001%的痕量菌準確檢出，從而系統完整地解析樣品中微生物菌相組成。李欣蔚等通過16S rDNA測序技術對自然發酵酸菜樣品中的多樣性組成進行了分析，與PCR-DGGE技術測定結果相吻合，證實了高通量測序的準確性[10]。在真菌鑒定方面主要有ITS測序技術和18S rDNA技術兩種，18S rDNA雖然能有效地鑒定出真核微生物的存在并進行物種注釋，但其準確度往往較低，在實際測序中常有部分真菌不能被分類。ITS測序技術較18S rDNA技術測序的準確度更高，對真菌微生物的鑒定能力更強。然而，高通量測序技術由于針對局部DNA區域的鑒定，因此，只能完成微生物屬水平鑒定。隨著三代測序的蓬勃發展，全長高通量序列測定可以彌補微生物在種水平鑒定上的空白。曹碧璇等利用16S rDNA基因全長序列分析鑒定出自然發酵酸菜液樣品中有7個細菌菌屬及9個菌種，實現了微生物多樣性在種水平上的解析[11]。高通量測序是對傳統測序的革新式改變，也是目前最常見的測序方法，成本低廉，且令對發酵食品全部基因的深入分析成為可能。

1.3 宏基因組技術

高通量測序技術促進了組學技術的發展，相較于高通量測序，宏基因組基于對現代基因組學技術的應用，其優勢在于不僅可以準確地對樣品進行物種注釋，而且可以進行功能注釋，挖掘部分微生物的功能基因對其代謝途徑進行預測，這為開發利用未知或未被培養的微生物、全面探究微生物基因功能性提供了研究基礎[12]。彭明芳等利用基因組技術對廣西酸菜進行功能注釋，結果共注釋到17種在碳水化合物和氨基酸代謝與轉運功能上豐富的基因，如纖維素酶、果膠酶、淀粉水解酶和酯酶等，預測了微生物在酸菜發酵過程中可能發揮的作用[13]。Guo等利用宏基因組技術在白酒窖泥中發現了乳酸菌、芽孢桿菌和梭菌等細菌與乳酸、乙酸等有機酸及乙醇、酯類等風味化合物產生有關，而半乳酵母、青霉菌和曲霉菌等真菌微生物在白酒發酵中可以產生葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶，這對糖酵解過程影響顯著并可將淀粉等大分子物質降解為小分子糖[14]，但宏基因組測序對數據處理核心技術的要求極高，當樣本數量極大時，需要進行多次測序，且宏基因組測序方法的定義和算法還不完善，是目前微生物學家面臨的一大難題。

目前對于研究發酵食品常用的測序方法如上所述，不同的方法各有特點，比如PCR-DGGE技術的高效快速，高通量測序技術的精準分析，基因組技術的功能基因注釋。在實際的應用選擇中，要結合樣品的狀態、測序的目的、預期的深度以及性價比進行合理選擇。

2 傳統發酵食品微生物多樣性及核心微生物研究進展

近些年來，學者們對傳統發酵食品的微生物多樣性展開了研究，產品主要涉及7大類，分別為發酵谷物類、豆類、乳類、蔬菜類、肉類、酸面團類和其他。每一類都包含許多具有代表性的發酵食品，具體產品分類見表2。本部分內容針對上述類別的中國傳統發酵食品中微生物多樣性研究進行了綜述。

表2 中國傳統發酵食品分類及代表產地

2.1 傳統發酵乳制品

中國傳統發酵乳制品主要分為兩類，分別是酸奶和奶酪，在新疆、內蒙古、西藏等地有著深遠的制作歷史。這些發酵乳制品的品質往往因為地理環境因素以及人為因素而呈現出微生物菌群組成上的差異，見表3。中國傳統發酵乳制品的微生物組成復雜多樣，不同地域的微生物組成各有特點，通過對傳統發酵乳制品微生物多樣性的解析，不僅可以更好地對其品質進行調控還對乳制品同質化以及有效溯源體制的建立有著重要的指導意義。

表3 不同產地發酵乳樣品微生物多樣性組成對比Table 3 The comparison of microbial diversity composition of fermented milk samples from different producing areas

2.2 傳統發酵谷物制品

2.2.1 發酵酒類制品

我國的酒文化歷史深遠，釀酒工藝傳承了幾千年，其中在釀酒過程中，發酵是一個關鍵的環節。中國發酵酒要經過獨特而復雜的系統發酵，由于原料不同，酒曲不同及發酵工藝不同等，衍生出不同種類的發酵酒，其中最具代表性的是白酒、黃酒及米酒。大量研究發現不同酒曲的微生物菌群結構差異較大，賦予了白酒和黃酒不同種香型，如清爽型、鳳香型、濃香型、芝麻香型等，見表4。

表4 不同香型發酵酒類微生物多樣性

此外，學者們還對部分酒曲的白酒以及不同原料的黃酒和米酒中的微生物多樣性進行了分析，其他酒曲的白酒及不同原料的黃酒和米酒中微生物種類和核心微生物的情況見表5。運用測序技術對發酵酒微生物群落結構進行解析可以更好地區分不同種類的酒以及工業化大規模生產酒。

表5 不同酒曲及原料發酵酒類微生物多樣性[24-30]Table 5 The microbial diversity of fermented wines with different kojis and raw materials

續 表

2.2.2 發酵醋制品

食醋在我們日常進行食物加工過程中是必備的酸性調味品之一。中國傳統醋的生產有固態、液態及靜態表面發酵之分。液態發酵具有更高的醋酸產量、更短的發酵時間和更低的成本，而固態發酵釀造的醋具有獨特的風味和口感。其中差異來自于不同發酵方式下微生物菌群結構與演替規律的差異。Jiang等對液態發酵制成的紅曲醋的微生物多樣性進行了測定，共鑒定出10個細菌屬和13個真菌屬，其中乙酰耐受乳桿菌為紅曲霉醋的優勢細菌屬，嗜鹽梗孢酵母為優勢真菌屬[31]。聶志強等對天津老醋的固態發酵生產過程中發現乳酸菌在整個發酵過程中均處于絕對優勢地位，為固態發酵醋的優勢細菌屬，但隨發酵持續進行，醋酸菌屬豐度也在逐漸升高，是重要的酸性產物代謝菌[32]。通過發酵醋制品菌群結構的解析及其對產品風味品質的影響分析，可以獲得用于發酵醋的優良菌株，實現產品的工業化生產和風味品質的調控。

2.2.3 發酵豆制品

發酵豆制品往往以大豆為原料，在不同制作工序及菌群結構的作用下成為不同的產品。不同發酵豆類制品在原料、發酵時間以及發酵工藝上微生物存在的差異見表6。

表6 不同發酵豆類制品核心微生物及其功能[33-37]Table 6 The core microorganisms in different fermented bean products and their functions

續 表

2.3 傳統發酵蔬菜制品

發酵是一種古老而廣泛使用的用來保存新鮮蔬菜的加工技術，如東北的酸菜、四川的泡菜和廣西的酸筍等。這些發酵蔬菜常因為地理區域與原材料的不同，經不同發酵工藝而有著不同的菌落結構，見表7。乳酸菌在大多數發酵蔬菜制品中廣泛存在，并起著關鍵的代謝作用和重要的功能性，許多研究也證實了乳酸菌在發酵蔬菜過程中產酸，形成醇、酯、醛等基礎風味，抑制腐敗，延長貨架期等[38]。

表7 常見發酵蔬菜優勢微生物種類[39-42]Table 7 The dominant microbial species of common fermented vegetables

2.4 傳統發酵魚、肉制品

傳統發酵肉制品通常采用較高濃度的鹽對原料進行腌制發酵，不同地區的發酵肉制品因原料、產地以及工藝的不同，微生物組成上存在著明顯的差異。如浙江金華火腿的核心發酵菌屬為乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬等[43]，而云南宣威火腿多為孢囊放線菌屬、乳酸桿菌、棒狀桿菌屬、小單孢菌屬、鏈霉菌，這些微生物菌群結構上的不同主要來源于樣品產地的差別[44]。此外，原料的不同造成了發酵肉制品微生物菌群結構的差異性并發揮著不同的功能，見表8。

表8 不同發酵肉制品主要核心微生物及功能[45-46]Table 8 The main core microorganisms and functions of different fermented meat products

2.5 傳統發酵酸面團

中國的傳統發酵酸面團制品主要以饅頭為主，傳統饅頭的制作大多以酵子為發酵劑。研究發現，酵子的來源決定了其微生物組成。楊可等發現關中不同地區的饅頭酵子中優勢菌屬均為乳酸菌屬，但不同地區的微生物組成差異較大。傳統酵子饅頭往往風味之間存在差異，這也與酵子中微生物的組成和代謝有著密切聯系[47]。Suo等利用高通量測序方法研究了中國傳統發酵劑發酵的饅頭的微生物多樣性及風味成分，結果顯示以乳酸桿菌和片球菌為主的優勢菌屬在呈味方面發揮著重要的作用[48]。馬凱等在對傳統酵子細菌多樣性的研究中進一步確定了乳酸菌中以魏斯氏菌屬與乳酸乳桿菌屬為主的優勢地位，并明確與商業酵母相比，醇類化合物的含量和種類是區分傳統酵子發酵饅頭與商業酵母的關鍵[49]。

此外，學者們還對發酵茶如普洱茶、黑茶等[50-51]傳統發酵食品中微生物多樣性進行了研究，為提高產品加工效益和食用品質提供了理論參考。

3 展望

中國傳統發酵食品種類多，微生物多樣性豐富，大多數仍停留在作坊式、家庭式的制作模式中，只有極少數發酵制品實現了工業化發展。這就使我國傳統發酵食品存在工藝缺乏創新、制作周期冗長、安全穩定性較差等原始問題，難以實現傳統發酵食品規模化、產業化發展。未來我們不僅需要全面了解傳統發酵食品中的菌群結構、關鍵微生物信息，還需要深入了解發酵過程中與風味或品質有關的功能性微生物的作用，對其發酵機理進行挖掘，獲得發酵性能優良的菌種，建立發酵食品菌種保藏庫，以期為人為調控中國傳統發酵食品的發酵過程，使中國傳統發酵食品規模化、產業化、安全化生產。