山楂中黃酮的提取工藝及其調節糖脂代謝的活性研究

于舒雁，田碩

(1.鄭州黃河護理職業學院，鄭州 450042；2.河南中醫藥大學，鄭州 450046)

1 概述

山楂又稱紅果、山里紅、酸里紅、酸棗等，為藥食兩用的植物[1]。山楂果實為圓球形，外皮紅色，表面具有斑點，在我國多地均有栽培。山楂入藥在我國有著悠久的歷史，《本草綱目》中記載其“酸甘味溫，消食積，補脾”[2]。大量藥理學研究表明，山楂具有消食健胃、行氣散瘀的作用，能促進人體內消化。山楂的生物活性物質多樣，主要有黃酮類和皂苷類，具有較強的抗氧化、調節血脂、抗癌和降低膽固醇等作用[3]。迄今為止，已從山楂中分離了近70種黃酮類化合物，主要有槲皮素、芹菜素、木犀草素等。

山楂中黃酮類化合物的提取方法眾多[4-5]，提取方法不同及山楂提取部位不同均能影響總黃酮的提取率，見表1。

表1 山楂總黃酮的提取方法以及工藝Table 1 The extraction methods and technology of total flavonoids from hawthorn

由表1可知，山楂果中總黃酮的提取率相對于干果，山楂鮮果更易提取出黃酮化合物。

現代藥理研究表明黃酮物質可通過多種機制調節糖代謝和脂質代謝。謝偉華用山楂黃酮短期處理小鼠，結果表明山楂黃酮化合物能降低小鼠血清中的甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)，并能顯著地提高高密度脂蛋白(HDL-C)水平[18]。黃欣欣以SD小鼠為實驗材料，研究分析了大果山楂黃酮類物質對高脂血癥小鼠相關指標的影響，結果表明大果山楂黃酮能有效降低小鼠血清和肝臟組織中TC和TG的含量[19]。

本課題組對山楂開展了黃酮化合物提取工藝和調節糖脂代謝的研究，分別以山楂果肉、山楂皮和山楂籽為研究材料，探討山楂果不同部位所含黃酮類化合物的差異。與此同時，本文還建立了小鼠高脂血模型，以期探討山楂黃酮化合物對小鼠糖脂代謝的影響。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

實驗材料：山楂鮮果，購于當地農貿市場。

實驗動物：清潔、健康小鼠60只，雄性，體重(25±2) g。

實驗試劑：0.4 mg/mL蘆丁標準液、纖維素酶(15000 U/g)、果膠酶(50 U/g)、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，血清TC和TG按照試劑盒的說明書進行操作。

實驗儀器：分光光度計、精密電子天平、干燥箱、離心機、恒溫水浴鍋、血糖測定儀。

2.2 實驗方法

2.2.1 山楂原料處理

選擇健康、色澤鮮紅、個大飽滿的山楂，洗凈后去皮、去籽。將山楂果肉、果皮切成小塊，再將山楂籽清洗干凈，分別置于80 ℃恒溫干燥箱中干燥。待山楂果肉、果皮和山楂籽干燥后進行粉碎，過80目篩，備用。

2.2.2 總黃酮含量測定方法

本文選用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定山楂中總黃酮的含量。取7支試管，按照表2依次添加0.4 mg/mL蘆丁標準液、無水乙醇、5% NaNO2溶液、10% Al(NO3)3溶液和4% NaOH溶液，充分搖勻后，用無水乙醇定容至25 mL，搖勻后室溫靜置15 min，并于510 nm處測定吸光度值。以蘆丁濃度為橫坐標，510 nm處吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y=5.497x+0.022，R2=0.999。其中x為蘆丁濃度(mg/mL)，y為在510 nm處測定的蘆丁吸光值，其相關系數R2=0.999。

表2 蘆丁標準溶液的曲線繪制Table 2 The curve drawing of rutin standard solution

2.2.3 山楂果肉、山楂皮和山楂籽中總黃酮的提取

精準稱取1.00 g山楂果肉、山楂皮和山楂籽粉末，置于帶冷凝管的圓底瓶中，按照料液比為1∶40 (g/mL)加入濃度為70%的乙醇40 mL，分別改變酶量和酶解時間，進行單因素實驗。酶解結束后，置于300 W微波中加熱90 s。

2.2.4 山楂果肉、山楂皮和山楂籽中總黃酮的測定

吸取1 mL待測樣品代替蘆丁標準溶液，其余操作與1.2.2一致，計算待測樣品中總黃酮的提取量，公式如下：

總黃酮提取量=山楂提取液中的總黃酮含量(mg)/山楂原料(g)。

2.2.5 纖維素酶量對總黃酮提取量的影響

纖維素酶量分別為10，20，30，40，50，60 mg，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃酶解2 h。反應結束后處理方法同1.2.3。

2.2.6 果膠酶量對總黃酮提取量的影響

果膠酶量分別為10，20，30，40，50，60 mg，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃提取2 h。反應結束后處理方法同1.2.3。

2.2.7 酶解時間對總黃酮提取量的影響

加入40 mg纖維素酶和50 mg果膠酶，70%的乙醇溶液40 mL，pH 6，60 ℃提取20，40，60，80，100，120，140，160，180 min。反應結束后處理方法同1.2.3。

2.2.8 構建小鼠高脂血模型

選取60只健康雄性小鼠，隨機均分為6個組：空白對照組、模型對照組、鹽酸二甲雙胍組、山楂黃酮低劑量組(1.0 g/kg)、中劑量組(2.0 g/kg)和高劑量組(3.0 g/kg)。除空白組外，其余5組均采用Bozóky等[20]研究的腹腔注射方法建立小鼠高脂血模型。將山楂黃酮粉溶于不同體積的生理鹽水中，制成不同濃度、粒徑約300 nm的均勻懸濁液，備用。小鼠高脂血模型建立后，每日灌胃給藥1次，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，給藥周期為21 d。末次給藥4 h后，小鼠經摘取眼球取血，全血離心后留血清待測。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 纖維素酶量對總黃酮提取量的影響

圖1 纖維素酶量對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of cellulose amount on the extraction amount of total favonoids

由圖1可知，纖維素酶量在10～40 mg之間，山楂總黃酮提取量隨著纖維素酶量的增加而增大。當纖維素酶的添加量為40 mg時，山楂總黃酮提取量最大，為70.8 mg/g。然而當纖維素酶添加量超過40 mg后，山楂總黃酮提取量不但不再增加，反而呈下降趨勢，原因可能是過多的纖維素酶會影響黃酮化合物的溶出。因此，山楂原料與纖維素酶的添加量比為1∶40 (g/mg)最佳。

3.1.2 果膠酶量對總黃酮提取量的影響

圖2 果膠酶量對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of pectinase amount on the extraction amount of total favonoids

由圖2可知，果膠酶添加量在10～50 mg之間時，山楂總黃酮提取量隨著果膠酶添加量的增加呈上升趨勢。當果膠酶量為50 mg時，山楂總黃酮提取量達63.1 mg/g。當果膠酶量超過50 mg時，山楂黃酮提取量呈下降趨勢，表明過量的果膠酶會影響黃酮類化合物的溶出。因此，山楂原料與果膠酶量的最佳比例為1∶50(g/mg)。

3.1.3 酶解時間對總黃酮提取量的影響

圖3 酶解時間對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction amount of total favonoids

由圖3可知，當酶解時間在20～120 min之間時，山楂總黃酮的提取量隨著酶解時間的延長而增大，當酶解時間為120 min時，總黃酮提取量高達109.4 mg/g。但酶解時間超過120 min后，山楂黃酮的提取量反而會下降，推測可能是因為酶解時間過長，導致胞內的雜質溶出，影響了黃酮類化合物的后續提取。因此，酶解的最佳時間為120 min。

3.2 提取山楂不同部位的總黃酮量

根據單因素實驗結果，以纖維素酶添加量40 mg、果膠酶50 mg、酶解時間120 min處理山楂原料，酶解結束后，將其置于300 W微波中加熱90 s，再按照2.2.4的測定方法檢測黃酮的提取量。

由圖4可知，與單微波法提取山楂中的總黃酮量相比，添加復合酶系(果膠酶和纖維素酶)能顯著地提高總黃酮的提取量，其中山楂果肉中總黃酮量提高了58.0%，山楂皮中總黃酮含量提高了54.3%，山楂籽中總黃酮含量提高了59.8%。山楂果中，黃酮提取含量由高到低為果肉>果皮>果籽。由此表明，山楂中不同部位所含有的黃酮量也不相同，其中山楂果肉中黃酮提取總量最高，可達117.5 mg/g，而山楂籽中黃酮的提取量最低，為25.6 mg/g。

圖4 兩種提取方法提取山楂不同部位的總黃酮量Fig.4 The amount of total flavonoids from different parts of hawthorn by two extraction methods

3.3 山楂果肉黃酮化合物對高脂血模型小鼠血脂指標的影響

表3 各組FBG、TG、TC和HDL-C水平(x±s)Table 3 The FBG, TG, TC and HDL-C levels (x±s) in each group mmol/L

由表3可知，與空白組相比，模型組中小鼠的FBG和血清中TG、TC含量明顯升高，而HDL-C含量顯著降低(P<0.05)，表明小鼠的高脂血癥模型建立成功。與模型組相比，經山楂黃酮高、中、低劑量處理后的小鼠，FBG和TC值均顯著降低(P<0.05)；山楂黃酮高劑量組血清內TG含量顯著降低，而HDL-C含量則明顯上升(P<0.05)；山楂黃酮中劑量組血清內TG含量也明顯降低(P<0.05)，但是HDL-C含量無顯著變化；山楂黃酮低劑量組血清內TG和HDL-C含量無顯著變化。與鹽酸二甲雙胍組相比，經山楂黃酮處理后小鼠血清中的TC含量顯著增高，HDL-C含量顯著減少(P<0.05)。

4 討論

本文探索了復合酶協同微波法提取山楂中總黃酮化合物的工藝條件，采用單因素實驗考察了纖維素酶、果膠酶的添加量和酶解時間對黃酮提取量的影響。研究表明最佳的纖維素酶添加量為40 mg/g，果膠酶的添加量為50 mg/g，酶解時間120 min，結合實驗室前期篩選的提取條件，最終獲得最佳的提取工藝為：纖維素酶40 mg/g和果膠酶50 mg/g，pH 6，酶解溫度58 ℃，酶解時間為120 min，乙醇濃度為70%，液料比為40∶1 (mL/g)。在此條件下，山楂果肉中總黃酮的提取量高達117.5 mg/g，山楂皮中總黃酮的提取量為75.9 mg/g，而山楂籽中總黃酮的含量最低，為25.6 mg/g。同時，本文也探討了山楂黃酮對小鼠糖脂代謝的影響，結果表明，山楂黃酮高、中、低劑量均可有效降低高脂血癥模型小鼠的FBG、TG和TC含量(P<0.05)，還能不同程度地提高HDL-C水平(P<0.05)，由此證實山楂中黃酮類化合物有益于改善細胞的糖脂代謝過程。本文通過對山楂黃酮的提取工藝及其對糖脂代謝的影響，可為山楂黃酮類化合物在保健品的研發上提供一定的借鑒意義，同時也間接地促進了山楂多元化產品的發展。