成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中品質的影響

姜納川,陳煉紅

(西南民族大學 食品科學與技術學院，成都 610041)

奶酪是利用發酵劑和凝乳酶，使鮮奶中的蛋白質通過發酵使鮮奶凝固，在這個過程中，乳清會被逐漸排除掉，伴隨著不斷的發酵反應，直至發酵成熟后，會形成一種發酵型食品，具有很高的營養價值[1]。所謂霉菌奶酪，即通過霉菌這種發酵劑所制成的奶酪。在市面上，霉菌奶酪的類別有多種，可根據其口感、外觀進行分類，如法國卡門貝爾奶酪和已打入中國市場的藍紋奶酪、白霉奶酪等。目前，國外的奶酪產品種類豐富，具有較高的產量和銷售量。然而，受飲食習慣的影響，奶酪在中國的發展遠不如西方迅猛。近年來，隨著國人健康意識的改觀，奶酪也成為一個新的消費熱點。但由于我國奶酪產業發展還不夠完善，霉菌奶酪的研究仍處于起步階段[2]，關于牦牛毛霉菌奶酪的研究更是鮮有報道。

奶酪的成熟過程涉及蛋白質分解、脂肪降解、糖酵解等很多生化反應，這對奶酪的品質和風味的保持具有重要意義。同時，成熟溫度會對諸多生化反應產生重要影響。所以通過關注奶酪的成熟條件尤其是溫度條件可以了解奶酪的特性變化。不同的奶酪，其對成熟所需具備的條件也會有所不同，包括成熟溫度、時間及室內濕度等[3]。從目前的相關研究來看，針對不同成熟溫度條件對牦牛毛霉菌奶酪品質所產生的影響的研究較少。

實驗選取藏區牦牛奶，以雅致放射毛霉菌為發酵劑制作奶酪，分析牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中理化性質的變化，并重點研究成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪品質的影響，以確定奶酪的最佳成熟溫度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳：四川省紅原縣，密度為1.035 g/cm3，滴定酸度為18°T，蛋白質和脂肪的含量分別為4.62%、6.82%；雅致放射毛霉菌發酵劑：成都市調味品研究所；R-704發酵劑、小牛皺胃酶(酶活力14000 U/g)：科漢森公司；乙醇、硫酸銅、濃鹽酸、三氯乙酸等分析純：成都市科龍化工試劑廠。

CR-400色差儀 日本Konica Minolta公司；TA.XT Plus質構分析儀 英國Stable Micro System公司；MP512-02精密pH計 德國Matthaus公司；SKD-800凱氏定氮儀、SKD-08S2紅外石英消化爐 上海沛歐分析儀器有限公司；Trace DSQ型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Thermo公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

新鮮牦牛乳→標準化→巴氏殺菌→冷卻→添加發酵劑→調pH→添加氯化鈣→添加凝乳酶→凝乳→切割→攪拌→堆釀→排乳清→壓榨成型→半成品→切塊→添加雅致放射毛霉菌→成熟→成品。

1.2.2 操作要點

新鮮牦牛乳在65 ℃下加熱30 min，待冷卻至32 ℃時，加入1%的發酵劑，然后攪拌均勻，32 ℃發酵之后，添加檸檬酸溶液，使牦牛乳的pH值調節到5.6，此時加入氯化鈣與凝乳酶，體積比例分別為0.02%、0.04%，牛乳凝固之后進行切割、攪拌、排乳清的工序，壓塊成型，將半成品奶酪切塊，塊狀尺寸30 mm3，在其表面均勻地噴灑0.3%(質量比)的雅致放射毛霉孢子液，在相對濕度為50%，溫度分別在20，25，30 ℃的條件下，放置成熟。在成熟的過程中，分別在第0，2，4，6，8，10天測定奶酪的各項指標。

1.2.3 指標檢測方法

1.2.3.1 感官評價

采用“三角測試”的方式，將本次實驗的樣品向評審員展示，結合表1的品評標準內容，對本次實驗樣品進行評分[4]。

表1 奶酪感官品評標準Table 1 The sensory evaluation standard of cheese

1.2.3.2 質構測定

參照李昂等的方法并加以修改進行測定[5]。干酪的硬度、黏性、彈性、凝聚性和咀嚼性等指標需要利用食品物性儀器進行測定。將樣品分割為5 cm×5 cm×3 cm的方塊，儲存在4 ℃冰箱中；測定參數：負載類型Auto-5 g；測試速度1 mm/s；下壓距離10 mm；保持時間0 s；探頭回復速度1 mm/s；探頭類型P0.5；每組干酪平行測定3次。

1.2.3.3 營養成分測定

水分含量的測定：參照GB 5009.3-2016中的相關方法[6]；灰分含量的測定：參照GB 5009.4-2016中的相關方法[7]；粗蛋白的測定：參照GB 5009.5-2016中的相關方法[8]；粗脂肪含量的測定：參照GB 5009.6-2016中的相關方法[9]。

1.2.3.4 色澤測定

對奶酪樣品進行切塊，從中間切開，用校準后的CR-400色差儀分別測定各個奶酪樣品的切面，結果用L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)表示[10]。

1.2.3.5 pH測定

在奶酪中加入質量比1∶1的蒸餾水，對其進行研磨處理，而后進行pH測定[11]。

1.2.3.6 pH 4.6醋酸鹽緩沖液可溶性氮含量(pH 4.6-SN)

參照劉會平等的方法進行測定[12]。

1.2.3.7 12%三氯乙酸溶液可溶性氮含量(12% TCA-SN)

參照GB 5009.124-2016中的相關方法進行測定[13]。

1.2.3.8 硫代巴比妥酸值(TBAV)

結合相關文獻，并對里面所用到的方法進行優化[14]。取8 g樣品研磨后放入錐形瓶中，用字符m做標記。添加7.5%三氯乙酸(0.1% EDTA-2Na)40 mL，用保鮮膜封口，超聲30 min后過濾。選取部分濾液4 mL，在其中加入4 mL TBA溶液，而后置于90 ℃的水浴鍋內，水浴40 min后取出待其冷卻，在1600 r/min條件下進行5 min的離心處理，再在上清液中加入氯仿4 mL，搖勻后將上清液取出，在523 nm和600 nm的條件下比色，參照以下公式計算：

1.2.3.9 酸價(ADV)

參照GB 5009.168-2016中的方法測定[15]。

1.2.3.10 牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中揮發性物質變化

本次實驗分析牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中，其揮發性風味物質所屬類別和相對含量，所采用的方法為頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用相結合的方法[16]。GC-MS測定的數據由儀器自帶的系統軟件(Xcalibur)進行分析處理，待鑒定化合物的質譜與NIST 08譜庫中的質譜對比，列出匹配度大于70%的揮發性物質。

固相微萃取條件：取5 g奶酪樣品放入20 mL頂空瓶中，將待吸附樣品在80 ℃水浴中平衡30 min，然后將已經老化好的萃取頭插入頂空瓶中進行萃取，吸附時間30 min。萃取結束后取出萃取頭，插入氣相色譜儀汽化室中進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：氦氣作載氣，流速1 mL/min，樣品通過DB-Wax(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛細管柱。色譜升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升到200 ℃，最后以10 ℃/min升到220 ℃，保持3 min。

質譜條件：電子電離源(electron ionization，EI)，電子能量70 eV，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描模式Scan，質量掃描范圍40～650 m/z。

1.3 數據處理分析

本實驗中的所有數據均為3次重復測定的平均值，結果表示方式為平均值±標準差。結合SPSS 20.0軟件，對實驗數據進行統計分析處理，從而得出平均值和標準差，再運用Duncan多重比較的方法，分析顯著性方差，得出顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪感官指標的影響

不同成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪感官的影響見圖1。

圖1 牦牛毛霉菌奶酪的感官評分Fig.1 The sensory scores of yak Mucor cheese

由圖1可知，隨著成熟時間的延長，牦牛毛霉菌奶酪的感官評分呈先上升后下降的趨勢，在第6天達到峰值。在成熟前期(0～2 d)，成熟溫度為30 ℃時的牦牛毛霉菌奶酪感官評分高于另外兩組；第6天時，在25 ℃溫度條件下培養的牦牛毛霉菌奶酪感官評分高于另外兩組。這是因為毛霉生長受溫度的影響，低溫時霉菌的生長和代謝較慢，所以成熟速度較慢；溫度升高，菌絲生長速度加快，不易產生孢子，蛋白質與脂肪均屬于較好分解的物質，因此成熟的速度被提升，可以促進奶酪形成最佳的組織狀態，口感也更佳；雖然在高溫下，霉菌初期階段能得到快速生長，但由于高溫的影響，蛋白質會加劇分解，損壞奶酪的內部組織結構，致使感官品質受到嚴重影響。

2.2 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪質構指標的影響

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪質構指標影響的結果見表2。

表2 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪質構的影響Table 2 Effect of ripening temperature on the texture of yak Mucor cheese

續 表

由表2可知，無論是哪一組牦牛毛霉菌奶酪實驗，在成熟的過程中，奶酪的硬度、膠黏性、彈性、咀嚼性均呈先上升后下降的趨勢，凝聚性呈下降趨勢。變化顯著的為硬度、膠黏性、咀嚼性(P<0.05)；彈性于第4天開始變化顯著，第6天達到峰值，之后呈下降趨勢(P<0.05)；凝聚性變化趨勢不顯著(P>0.05)。當成熟溫度為25 ℃時，牦牛毛霉菌奶酪的膠黏性、凝聚性、彈性、咀嚼性高于另外兩組，升高成熟溫度，硬度的變化趨勢為逐漸下降。這是因為溫度較低時，霉菌發酵活力低，不易分解奶酪中的脂肪，奶酪的硬度較大，溫度升高，奶酪中脂肪分解加快，硬度逐漸下降，引起奶酪結構變化，而溫度越高，酪蛋白水解程度越大，奶酪的質構越受影響。當成熟溫度為25 ℃時，質構指標較為理想，組織狀態良好。培養前期，酪蛋白降解作用和凝聚作用速度較快，霉菌發酵作用促進脂肪的分解，此時各指標均呈現上升的趨勢。因此，不同的成熟溫度對奶酪質構特性的影響顯著。在產品生產時，通過調整成熟溫度可有效控制產品的質構指標。

2.3 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪營養成分的影響

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪營養成分影響的結果見表3。

表3 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪營養成分的影響

由表3可知，3組牦牛毛霉菌奶酪的水分含量隨著成熟時間的增加大體呈顯著下降趨勢(P<0.05)。成熟溫度25 ℃的水分含量一直高于另外兩組(P>0.05)；灰分隨著成熟時間的增加呈逐漸上升趨勢(P<0.05)，隨著成熟溫度的升高和成熟時間的延長，蛋白質含量、脂肪含量和水分含量均呈下降趨勢，但下降趨勢不明顯(P>0.05)；不同溫度對蛋白質和脂肪的影響不顯著(P>0.05)。原因在于奶酪中的水分以不同形式存在，而溫度的升高使奶酪表面的水分因蒸發作用而減少，并且會因為蛋白質降解破壞奶酪內部結構，引起結合水的變化，酪蛋白分子間的聚集和乳清的排出，使奶塊脫水收縮。同時，較高的成熟溫度可使微生物繁殖和代謝加快，從而引起奶酪中酶活力增強，多肽降解反應加快。在微生物和酶的作用下，酪蛋白水合作用增強更傾向于水解，蛋白質和脂肪降解形成許多小肽和氨基酸等物質，導致蛋白質和脂肪含量下降。在奶酪成熟過程中，礦質元素等無機鹽成分沒有消耗，而其他營養成分含量的降低使奶酪總體質量減少，加之蛋白質網狀結構的固著作用，使灰分含量呈上升趨勢。

2.4 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪色澤變化的影響

在20，25，30 ℃ 3種成熟溫度下，牦牛毛霉菌奶酪成熟期間的色澤變化結果見圖2。

圖2 奶酪成熟期間L*值的變化Fig.2 The changes in L* values of cheese during ripening period

由圖2可知，隨著奶酪成熟時間的延長，L*值呈先上升后下降的趨勢，在第6天達到峰值。這是因為溫度升高，蛋白酶和肽酶活性增強，蛋白質更容易分解，亮度值較高的酪蛋白數量減少越快，所以L*值降低。奶酪成熟初期，脂肪分解速率大于蛋白質分解速率，酪蛋白數量降低不明顯，所以L*值上升。奶酪成熟至第6天時，蛋白質分解速率超過脂肪分解速率，脂肪在呈色物質中比例上升，所以L*值下降。

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪a*值的影響見圖3。

圖3 奶酪成熟期間a*值的變化

由圖3可知，牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中，當成熟溫度為30 ℃時，奶酪的a*值高于另外兩組，且隨著奶酪的成熟，a*值呈上升的趨勢。這是因為成熟前期，奶酪中的紅綠色素被脂類物質包裹，所以顏色偏綠，紅綠值為負。且成熟溫度越高，脂類物質更容易被乳酸菌和凝乳酶分解，奶酪中的紅綠色素釋放更快，成熟超過6 d，奶酪逐漸呈現出應有的色澤。

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪b*值的影響見圖4。

圖4 奶酪成熟期間b*值的變化Fig.4 The changes in b* values of cheese during ripening period

由圖4可知，牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中，奶酪的b*值隨著溫度的升高而上升，且隨著奶酪的成熟，b*值呈上升趨勢。這是因為隨著成熟時間的延長，蛋白質不斷被乳酸菌和凝乳酶分解，部分酪蛋白的網狀結構被破壞，且溫度越高，破壞越嚴重，脂肪逐漸釋放出來，奶酪中游離的黃色素增多，所以b*值不斷升高。

2.5 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪pH的影響

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪pH影響的結果見圖5。

圖5 奶酪成熟期間pH的變化Fig.5 The changes in pH values of cheese during ripening period

由圖5可知，隨著成熟溫度的升高，pH值的下降幅度逐漸增大；隨著成熟時間的延長，pH值先大幅度下降后降幅減緩或稍有上升。這是因為溫度越高，奶酪中膠體磷酸鈣的溶解性降低，使磷酸鈣數量增加，H+從PO43-中分解出，從而使H+含量增加[17]。另外，霉菌活性也隨溫度升高而增強，霉菌活性越強，酸化能力越強，奶酪蛋白質含量的迅速降低和水分含量的增加影響了對乳酸的緩沖能力，所以pH值的下降幅度越大。成熟前期，發酵劑處于生長期，并且奶酪中的乳糖轉化成乳酸的過程使pH值不斷降低，第6天后，酸度過大對霉菌活性起抑制作用，使其酸化能力降低，此時乳糖幾乎分解完畢，有些細胞呈現自溶現象且產生堿性物質，奶酪的pH值有所增加或下降速度降低。

2.6 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪蛋白質分解指標的影響

2.6.1 醋酸鹽緩沖液中可溶性氮含量的測定

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪醋酸鹽緩沖液中可溶性氮含量影響的結果見圖6。

圖6 牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中pH 4.6可溶性氮含量的變化Fig.6 The changes in soluble nitrogen content at pH 4.6 of yak Mucor cheese during ripening

由圖6可知，隨著成熟時間的推移，pH 4.6可溶性氮含量會逐漸增高，且在成熟溫度25 ℃時，pH 4.6可溶性氮含量最高。這是由于成熟溫度過低或過高時，毛霉活力不高，發酵程度不足，蛋白質分解能力差。同時，在成熟初期，pH 4.6可溶性氮含量上升趨勢較快、變化較大，這是由于干酪成熟初期凝血酶活性較高，促使酪蛋白加快了水解的速度。在成熟達到一定階段，此時pH 4.6可溶性氮含量會逐漸減緩上升速度，這就反映出兩個現象：一是凝乳酶的活力下降，二是蛋白質水解速度降低[18]。

2.6.2 12%三氯乙酸(TCA)可溶性氮含量的測定

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪12%三氯乙酸可溶性氮含量影響的結果見圖7。

圖7 牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中12%三氯乙酸可溶性氮含量的變化Fig.7 The changes in soluble nitrogen content of 12% trichloroacetic acid of yak Mucor cheese during ripening

在牦牛毛霉菌奶酪成熟過程中，12%三氯乙酸可溶性氮含量一直呈上升趨勢，這也證實了酪蛋白在奶酪成熟的過程中會發生強烈的水解。在成熟溫度為25 ℃下成熟時，12%三氯乙酸可溶性氮含量最高。這主要是因為此時毛霉和細菌都會產生大量的蛋白酶，蛋白酶活性不斷提高，酪蛋白會引發降解的現象，從而將大肽分解成小肽和氨基酸。

2.7 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪脂肪分解指標的影響

2.7.1 酸價的變化

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪酸價變化的影響見圖8。

圖8 霉菌牦牛奶酪成熟過程中酸價的變化Fig.8 The changes in acid values of yak Mucor cheese during ripening

由圖8可知，隨著成熟時間的延長，奶酪的酸價逐漸升高，說明脂肪的水解過程一直在持續。前期增長較快，后期趨于穩定，這主要是奶酪成熟過程中干酪脂肪不斷降解以及霉菌與凝乳酶喪失活力造成的。奶酪中的脂肪分解后會產生醇類、酯類、醛類以及游離脂肪酸等風味物質，是構成奶酪獨特風味的重要因素。

2.7.2 硫代巴比妥酸值的變化

成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪硫代巴比妥酸值影響的結果見圖9。

圖9 霉菌牦牛奶酪成熟過程中硫代巴比妥酸值的變化

由圖9可知，在成熟溫度為25 ℃時，奶酪的硫代巴比妥酸值最高。隨著成熟時間延長，奶酪的硫代巴比妥酸值逐漸升高，說明在奶酪成熟過程中脂肪一直在發生氧化反應。并且上升速率隨時間的增加而增大，這是由于在成熟溫度為25 ℃時，菌株活力好，脂肪的氧化程度高，隨著奶酪成熟時間延長，脂肪氧化速率也在增加。

2.8 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪揮發性成分的影響

表4 成熟溫度對牦牛毛霉菌奶酪風味物質的影響

由表4可知，從樣品中檢測得出的風味物質成分有很多種，包括酮類、醇類、酸類、醛類、酯類等，含量最高的化合物為酸類化合物。在成熟溫度為25 ℃條件下，成熟到第6天時，所檢測到的風味物質含量達到了最高值，約為96.74%。

在奶酪發酵和成熟的過程中，由于脂肪或者氨基酸的降解，形成了牦牛毛霉菌奶酪中的酸類化合物，而這正是用以評價奶酪成熟的重要標志之一。在成熟的過程中，揮發性酸的含量是比較大的，這類物質即便是在不同的發酵階段，其相對含量也會比較高，但隨著成熟時間的推移，總體的含量也會逐漸減少[19]。對于此類型奶酪，雖然酮類物質以丁酮及甲基酮化合物為主，但總的含量比重并不大。酯類物質包含5種化合物，即癸酸乙酯、癸酸丙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯，而黃油酯則是這幾種物質的混合物總稱[20]。濃郁奶香是酯類物質的特征，這種特征對奶酪香氣的形成起到重要的作用。

3 結論

在成熟溫度為25 ℃、成熟時間為6 d時，奶酪有著最佳的質構指標。伴隨著成熟時間的推移，3組牦牛毛霉菌奶酪的感官評分與質構指標呈先上升后下降的趨勢，在第6天時達到峰值；而蛋白質含量、水分含量、脂肪含量都呈現逐漸下降的趨勢，其中下降最為顯著的為水分含量(P<0.05)；灰分含量呈上升趨勢(P<0.05)；紅綠值(a*)和黃藍值(b*)呈上升趨勢，亮度值(L*)呈下降趨勢；pH值呈先下降后不變或略微上升的趨勢；pH 4.6可溶性氮含量、12%三氯乙酸可溶性氮含量均呈上升趨勢，蛋白質不斷分解。在同一成熟時間點，溫度為25 ℃的膠黏性、凝聚性、彈性、咀嚼性明顯高于其他兩組(P<0.05)；溫度為25 ℃的水分含量高于其他兩組(P>0.05)；灰分含量、蛋白質含量和脂肪含量變化不顯著(P>0.05)。通過檢測得知，當成熟溫度在25 ℃條件下，成熟時間為6 d時，奶酪的風味物質含量為最高值。

結合實驗結果，綜合各項評定指標得出結果：當牦牛毛霉菌奶酪處于成熟溫度25 ℃條件下，成熟時間為6 d時，奶酪的品質最佳。