細葉韭花醇提物體外抗氧化及對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

李美萍，侯健，劉燕，尉立剛，郭彩霞

(山西大學 生命科學學院，太原 030006)

細葉韭花作為北方地區傳統的調味品，經油炸后呈現濃郁香味，且有多種含硫化合物[1-2]，有抗菌、預防動脈硬化和心血管疾病、抗過敏等功效[3]。細葉韭花中含有多種營養物質，如蛋白質、氨基酸等[4]。隨著餐飲業的發展以及人們崇尚“自然”、講求天然的想法，目前，細葉韭花在中國北方餐飲業家喻戶曉，尤其獨特的風味贏得了消費者的青睞。到目前為止，國內對其物候學、生物學特性以及栽培技術的文獻報道相對較多，而對其風味成分、提取物化學成分以及抑菌、抗氧化能力的研究則相對較少[5-9]。近年來，天然的抗氧化劑及降血糖藥物愈發受到人們的關注[10-13]。細葉韭花作為新型的藥食同源調味品，其醇提物的抗氧化及降血糖作用研究并未見報道。在前期研究工作的基礎上，本實驗繼以乙醇為溶劑，用不同濃度的乙醇提取細葉韭花中有效成分，并對其抗氧化及降血糖實驗進行了研究，以期找到細葉韭花醇提物的最佳濃度，為利用細葉韭花天然的抗氧化性開發新產品、風味復合調味品建立獨特的地方產品特色提供了數據上的支持與理論上的指導。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

細葉韭花：采自山西省朔州市；α-葡萄糖苷酶、PNPG：美國Sigma公司；阿卡波糖：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器

UV-Probe 2550雙光束紫外光譜儀 日本島津公司；Infinite M200 Pro多功能酶標儀 Tecan公司。

2 實驗方法

2.1 細葉韭花醇提物的制備

參考文獻[9]，稱取一定量細葉韭花粉末，按1∶15的料液比加入不同濃度乙醇提取劑，置于250 mL具塞錐形瓶中，在40 ℃下恒溫浸提30 min，減壓抽濾得上清液，濾渣再次提取，合并所得濾液，蒸發濃縮得浸膏。用30%乙醇溶解上述浸膏即為本實驗所用的細葉韭花醇提液。

2.2 細葉韭花醇提物體外抗氧化作用

2.2.1 清除DPPH自由基能力

測定方法參照文獻[14-17]，稍作修改。準確稱取0.0015 g DPPH配制成0.1 mmol/L的標準試液，避光保存。分別移取上述不同乙醇濃度提取液2 mL于10 mL試管中，再加入2 mL DPPH溶液，避光放置30 min，于517 nm波長處測吸光度(Ai)。用Vc做陽性對照，每樣重復3次，取平均值。清除率按照公式(1)進行計算。

(1)

式中：Ai為提取液+DPPH的吸光度；Aj為乙醇+提取液的吸光度；A0為乙醇+DPPH的吸光度。

2.2.2 細葉韭花醇提物對ABTS自由基清除能力的測定

對ABTS自由基清除能力的測定參照文獻[14-18]，并適當修改。準確稱取0.0200 g ABTS于10 mL樣品瓶中，加入2.4 mmol/L的過硫酸鉀5.2 mL溶解，得到ABTS母液，避光12 h。準確移取ABTS母液1.6 mL，用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中，保存待用。分別在10 mL具塞試管中依次加入上述不同乙醇濃度提取液、ABTS溶液各2 mL，并用蒸餾水定容至刻度，避光保存30 min，在734 nm波長處測吸光度值。用Vc做陽性對照，每樣重復3次，取平均值。清除率按照公式(2)進行計算。

(2)

式中：Ai為提取液+ABTS的吸光度；A0為蒸餾水+ABTS的吸光度。

2.2.3 細葉韭花醇提物總還原力能力的測定

對總還原力能力的測定參照文獻[16]和文獻[19]，并稍作修改。取1 mL提取液于10 mL試管中，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2 mL、1%的鐵氰化鉀2 mL，混勻，于50 ℃恒溫水浴20 min，冷卻后加入10%的三氯乙酸2 mL，4000 r/min離心10 min。取離心后的上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水、0.1%的三氯化鐵0.4 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm下測其吸光度值。用Vc做陽性對照，每樣重復 3 次，取平均值。

2.3 細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定參照文獻[17-20]，并適當修改。用0.1 mol/L pH 6.8磷酸鈉緩沖液配制1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和1.0 mmol/L PNPG溶液。將600 μL 1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶、200 μL磷酸鈉緩沖液，以及各200 μL不同濃度樣品提取液(50，60，70 mg/mL)混勻，在37 ℃ 恒溫水浴10 min，再加入200 μL 1.0 mmol/L PNPG，恒溫反應30 min，最后加入2 mL 0.5 mol/L的Na2CO3使反應終止，于400 nm波長處測定吸光度。用阿卡波糖做陽性對照。抑制率按照公式(3)進行計算。

(3)

式中：A0為用磷酸緩沖溶液代替樣品的吸光度；Ai為加細葉韭花提取物的吸光度；Aj為用磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液的吸光度。

2.3.2 酶動力學的測定

對α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學實驗參照文獻[17-20]的方法，稍作修改。酶濃度不變(1.0 U/mL)，設置6個底物PNPG濃度。樣品設置0，3 mg/mL兩個濃度，按上述2.3.1中的方法進行，在400 nm處測定吸光度，每隔5 min測一次。以底物濃度的倒數(1/S)為橫坐標，以反應速度的倒數(1/V)為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線，確定樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

3 結果與討論

3.1 細葉韭花醇提物抗氧化

3.1.1 細葉韭花醇提物對DPPH自由基的清除作用

實驗考察了0.05，0.1，0.2，0.4 mg/mL的濃度梯度下乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力，并比較了不同濃度Vc與60%醇提物清除DPPH自由基能力，其清除率測定結果見圖1和圖2。

圖1 細葉韭花醇提物對DPPH自由基清除率的測定Fig.1 Determination of DPPH free radical scavenging rates by ethanol extracts from Allium tenuissimum L. flowers

由圖1可知，不同的細葉韭花醇提取物在0.05～0.4 mg/mL濃度范圍內，對DPPH自由基的清除能力隨著提取物濃度的增大而增強。在測試濃度范圍內，細葉韭花60%醇提物的抑制效果最好，0.4 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到83%。

圖2 Vc與60%醇提物對DPPH自由基清除率的測定Fig.2 Determination of DPPH free radical scavenging rates by Vc and 60% ethanol extract

由圖2可知，Vc對DPPH自由基的清除率優于60%醇提物。當60%醇提物濃度增大到0.8 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率與0.1 mg/mL的Vc相當。

3.1.2 細葉韭花醇提物對ABTS自由基的清除作用

實驗考察了0.05，0.1，0.2，0.4 mg/mL的濃度梯度下乙醇提取物對ABTS自由基的清除能力及不同濃度的Vc與60%醇提物對ABTS自由基清除能力的比較，其結果見圖3和圖4。

圖3 不同提取物對ABTS自由基清除率的測定Fig.3 Determination of ABTS free radical scavenging rates by different extracts

圖4 Vc與60%醇提物對ABTS自由基清除率的測定Fig.4 Determination of ABTS free radical scavenging rates by Vc and 60% ethanol extract

由圖3可知，細葉韭花醇提物對ABTS自由基具有良好的清除能力，且隨著提取物濃度的增大其對ABTS自由基的清除能力越強，其中60%的細葉韭花醇提物對ABTS自由基的清除能力最強，在0.05～0.4 mg/mL濃度范圍內，清除率分別達到38.34%、49.55%、66.69%、78.57%。

由圖4可知，0.8 mg/mL 60%醇提液對ABTS自由基的清除能力與0.1 mg/mL的Vc能力相當。

3.1.3 細葉韭花醇提物總還原能力的測定

實驗考察了1，2，3，4 mg/mL的濃度梯度下乙醇提取物總還原力的測定及不同濃度的Vc與60%醇提物總還原力的比較，其結果見圖5和圖6。

圖5 不同提取物對總還原力的測定Fig.5 Determination of total reducing ability of different extracts

圖6 Vc與60%醇提物對總還原力的測定Fig.6 Determination of total reducing ability of Vc and 60% ethanol extract

在2.2.3的條件下測定了不同提取物在不同濃度下的總還原能力，結果用吸光度值表示，吸光度值越大，其總還原能力越強。由圖5可知，隨著醇提物濃度的增加，其還原能力越強，且60%醇提物的還原能力最強。

由圖6可知，VC對總還原力的作用強于60%的醇提物，且它們均隨著濃度的升高對總還原力的作用增強。

3.2 細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3.2.1 細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

實驗考察了50，60，70 mg/mL濃度梯度下乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及不同濃度的阿卡波糖與60%醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的比較，其結果見圖7和圖8。

由圖7可知，當樣品質量濃度為50～70 mg/mL時，細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯。當細葉韭花醇提物濃度為50 mg/mL時，最高抑制率可達55%。當細葉韭花醇提物濃度為70 mg/mL時，最高抑制率可達83%。

圖7 不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定Fig.7 Determination of different extracts on the inhibition rates of α-glucosidase

圖8 阿卡波糖與60%醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

由圖8可知，阿卡波糖和60%的細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶均具有抑制效果且具有濃度依賴性，當醇提物濃度達40 mg/mL時，與6 mg/mL阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果相當，其半抑制率(IC50)分別為6.67 mg/mL(阿卡波糖)，45.95 mg/mL(60%醇提物)；IC50值表明，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果強于細葉韭花60%的醇提物。這可能是由于細葉韭花醇提物中主要的化學成分是紫云英苷，屬于黃酮類化合物，有研究表明黃酮類化合物的降血糖機制能促進胰島素的分泌；并且黃酮類化合物只有與其他活性組分協同作用，才能抑制α-葡萄糖苷酶的活性。因此，細葉韭花醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較阿卡波糖低，可能與提取物中其他活性成分的含量不同有關。

3.2.2 細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型

加入不同濃度的60%細葉韭花醇提物后，按照2.3.2方法繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線，結果見圖9。

由圖9可知，在未加入細葉韭花醇提物(0 mg/mL)的反應中，所得曲線方程為y=139.89x+20.25，R2=0.995，同時計算得Vm=0.049，Km=0.069；在加入3 mg/mL細葉韭花醇提物的反應中，得擬合曲線方程y=363.85x+147.17，R2=0.971，計算得Vm′=0.0068，Km′= 2.474。由此可見，加入低濃度細葉韭花醇提物抑制反應后，Vm減小，α-葡萄糖苷酶的米氏常數Km增大，即低濃度細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶為反競爭性和非競爭性混合的抑制類型。另外，以抑制類型圖中的斜率對抑制劑濃度二次作圖，求得細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制常數 Ki=1.92。

圖9 不同濃度樣品與α-葡萄糖苷酶反應的Lineweaver-Burk雙倒數曲線Fig.9 Lineweaver-Burk double reciprocal curves of α-glucosidase reaction with different concentration of samples

4 結論

本實驗對細葉韭花醇提取物體外抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制效果進行了研究。結果表明，細葉韭花醇提物能夠有效地清除DPPH和ABTS自由基，且有很強的總還原能力，并能很好地抑制α-葡萄糖苷酶，其中尤以60%乙醇提取物的效果最佳。同時，細葉韭花醇提物的抗氧化性與α-葡萄糖苷酶的抑制作用均呈濃度依賴性。前期實驗表明，60%乙醇提取物中主要成分為紫云英苷，其化學名為山奈酚-3-葡萄糖苷，具有黃酮類化合物的抗炎、抗氧化、抗菌等作用。所以，深入研究細葉韭花醇提取物的抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制效果對延緩衰老、預防糖尿病等方面具有重要意義。隨著未來食品技術、工藝的不斷提高，為地方企業開發復方調味品以滿足消費者日漸提升的烹飪需求提供一定的理論基礎，同時，細葉韭花提取物具有潛在的天然抗氧化性和抑菌作用，為其進一步應用到菜肴保鮮和肉制品品質延長均有一定的實驗依據，既可以實現地方獨特的產品特色，又可以實現產品由現在的單一向多元化轉變，對地方經濟增長具有促進作用。