三種黑蒜醋揮發性風味和有機酸成分分析

史玉，黃一承，曾承，楊定寬，王玉超，李曉磊，李丹

(長春大學農產品加工吉林省普通高等學校重點實驗室，長春 130022)

黑蒜又稱黑大蒜、發酵黑蒜、黑蒜頭，是將新鮮生蒜置于高溫、高濕的環境中自然發酵一定時間而制得的新型蒜制品[1]。黑蒜沒有新鮮生蒜的刺激性辛辣味，且酸甜適口、口感軟糯[2]。現代研究表明，黑蒜中含有多糖類、多酚類、生物堿、黃酮類、游離氨基酸類、含硫化合物等成分，具有抗腫瘤、抗氧化、殺菌消炎、調節血糖、提高免疫力等作用[3-6]。近年來，國內外以黑蒜為原料的保健品、功能食品逐漸受到人們的喜愛。

食醋是通過發酵產生的傳統酸味液態調味品，多由糯米、高粱、大米、玉米、小麥以及糖類和酒類發酵而成，含有多種有機酸、川穹嗪等營養成分，具有增強食欲、促進消化、降血脂等功效[7-8]。黑蒜醋是以黑蒜為原料，經熬制榨汁、酒精發酵和醋酸發酵等工藝制成的口感獨特、氣味濃厚的液態調味品，對腸胃和心腦血管疾病的預防具有顯著作用，具有廣闊的發展前景。目前對黑蒜醋的研究主要在釀造工藝研發階段[9-10]，對黑蒜醋風味和有機酸成分的分析甚少。

本研究應用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)和高效液相色譜技術(high performance liquid chromatography,HPLC)對3種不同產地黑蒜醋的揮發性風味物質和有機酸組成及含量進行分析檢測，并進行相對氣味活度值分析，以期為黑蒜醋的呈味物質檢測和評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市場購買的3種黑蒜醋，產地分別為山東菏澤(產品A)、山東聊城(產品B)、山東煙臺(產品C)、氯化鈉(化學純)：上海Aladdin公司；亞鐵氰化鉀(分析純)：沈陽試劑三廠；硫酸鋅(分析純)：北京化工廠；乙酸、乳酸、蘋果酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸和馬來酸標準品：均為色譜純，美國Sigma公司。

0.22 μm疏水式針式過濾器 上海安譜實驗科技股份有限公司；15 mL頂空進樣瓶、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭 美國Supelco公司；DB-5MS UI毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國Agilent公司；Acclaim OA色譜柱(4.0 mm×250 mm×5 μm) 美國Thermo Fisher公司；QP2010 Ultra氣相色譜-質譜聯用儀 日本Shimadzu公司；Centrifuge 5430離心機 德國Eppendorf公司；P680A LPJ-4高效液相色譜儀 德國Dionex公司。

1.2 方法

1.2.1 SPME-GC-MC分析

取0.50 mL黑蒜醋樣品、1.50 mL蒸餾水和1.00 g氯化鈉于15 mL頂空瓶中，并加入磁力攪拌子，密封置于200 r/min的磁力攪拌器上，每次萃取前60 ℃預平衡20 min。

SPME條件：用已老化好的萃取頭頂空吸附60 min，然后將萃取頭拔出頂空瓶并迅速插入GC進樣口解吸5 min，同時啟動升溫程序。

GC條件：進樣口溫度為250 ℃，分流比為1∶5，5 min后吹掃流量為20 mL/min；載氣為He，柱流量為1.0 mL/min；程序升溫條件：初始柱溫40 ℃，保持5 min，以2 ℃/min的速率升至50 ℃，保持1 min；以4 ℃/min的速率升至120 ℃，保持1 min；以2 ℃/min的速率升至140 ℃，保持2 min后再以4 ℃/min的速率升至250 ℃，保持4 min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃；GC-MS接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍(m/z)35～600，全掃描模式。

1.2.2 ROAV的計算

為了快速篩選出所檢測的揮發性風味物質中氣味活度值最高的若干種物質，劉登勇等[11]定義了一個新參數：相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)。用ROAV對黑蒜醋中揮發性風味物質的相對貢獻進行量化，以確定關鍵風味物質。使對黑蒜醋氣味貢獻最大的物質的ROAV為100，對其他風味物質的ROAV按下式計算：

式中：C%i和C%max分別為揮發性風味物質和對樣品總體揮發性風味貢獻最大的相對含量(%)；Ti和Tmax分別為揮發性風味物質和對樣品總體揮發性風味貢獻最大的感覺閾值(μg/L)。 ROAV越大的物質對樣品總體揮發性風味的貢獻作用越大：100≥ROAV≥1的組分為樣品中的關鍵揮發性風味物質；1>ROAV≥0.1的組分為總體揮發性風味的修飾物質；0.1>ROAV的組分認為對總體揮發性風味無貢獻。

1.2.3 有機酸含量的測定

分別取4.00 mL樣品，加入4.00 mL 10.6%亞鐵氰化鉀和4.00 mL 30%硫酸鋅溶液，用蒸餾水定容到40 mL，置于6000 r/min的離心機中離心6 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待測。

HPLC條件：流動相：100 mmol/L Na2SO4(pH 2.65)；檢測波長：UV 210 nm；流速：0.50 mL/min；進樣量：5.00 μL。

2 結果與分析

2.1 不同產地黑蒜醋揮發性風味物質分析

對3種黑蒜醋揮發性風味物質進行分析，結果見圖1。

圖1 3種黑蒜醋揮發性風味物質色譜圖Fig.1 The chromatograms of volatile flavor compounds in three kinds of black garlic vinegar

表1 3種黑蒜醋揮發性風味物質SPME-GC-MS分析結果Table 1 SPME-GC-MS analysis results of volatile flavor compounds in three kinds of black garlic vinegar

續 表

采用保留指數和NIST 11標準譜庫檢索對比定性分析，保留與標準質譜庫相似度大于80%的化合物。由表1可知，共鑒定出53種揮發性物質，其中包括酸類8種、酯類17 種、醇類10種、醛類8種、酮類4種、酚類3種、雜環類2種和醚類1 種。3種黑蒜醋的揮發性物質數量分別為33種(產品A)、34種(產品B)、26種(產品C)。

酸味從味覺上和嗅覺上都是醋類產品最直觀的味道，也是影響醋類產品風味和品質的重要化合物[12]。由表1可知，3種黑蒜醋樣品中共檢測出8種酸類風味物質，其中乙酸、山梨酸、苯甲酸是共有的揮發性成分。山梨酸在產品B和C所有揮發性物質中相對含量最高，為35.87%～35.89%，苯甲酸在產品A中含量最高，為23.95%，這兩種酸可能是作為食品防腐劑在生產工藝中添加到產品中的；乙酸相對含量少于18%，但乙酸的閾值也低，對于產品風味的影響較大[13]。其余脂肪酸可以增加黑蒜醋風味的復雜性。這些酸類風味物質在黑蒜醋中互相作用影響，從而賦予了3種黑蒜醋獨特的酸味。

酯類物質對醋的揮發性風味有重要影響，多數產生于醋的發酵階段，具有花果的清香或蜂蜜的甜香，是評價醋類產品的重要指標[14]。由表1可知，3種黑蒜醋中共檢測出17 種酯類揮發性物質，產品A中酯類揮發性物質相對含量最高，為33.03%；產品B中酯類揮發性物質數量最多，為13種。乙酸乙酯在產品A和C酯類揮發性物質中相對含量最高，為14.75%～21.44%，在較低濃度下也可以增加醋的香氣[15]。不同酯類揮發性物質為黑蒜醋貢獻不同的香氣成分。

醛酮類揮發性物質中糠醛、5-羥甲基糠醛、苯甲醛、苯乙醛和橙化基丙酮是共有的揮發性成分。酮類物質是經過微生物氧化、氨基酸降解以及不飽和脂肪酸的熱氧化分解而產生的。通過微生物發酵或氨基酸降解產生的具有花香和水果香味的醛類物質可以提高醋的品質[16]。美拉德反應使戊糖降解形成糠醛[17]，5-甲基糠醛是類黑精形成的中間產物，也是黑蒜醋在發酵過程中經歷美拉德反應所產生的[18]，為食醋增香調色，但過量的糠醛和5-甲基糠醛對于身體健康會有不良作用[19]。苯甲醛廣泛存在于植物中。

黑蒜醋中還含有醇酚類、雜環類、醚類等揮發性物質。醇酚類揮發性物質中苯乙醇是共有的，也是相對含量最高的揮發性成分，是由酵母菌代謝產生的或在蛋白質水解過程中由氨基酸脫羧形成的[20]；檢測出的3種揮發性酚類物質相對含量均較低，可能來自黑蒜本身或醋酸發酵過程由酚酸降解產生[21]。川穹嗪和2,3,5-三甲基吡嗪雜環類揮發性物質是從產品B中檢測出的，是伴隨著美拉德反應生成的，對醋的風味有著重要影響[22]。醚類揮發性物質是從產品A中檢測出的，是黑蒜醋的重要特征性風味。這些化合物相互作用賦予了3種黑蒜醋獨特的風味。

2.2 ROAV分析

表2 3種黑蒜醋ROAV及氣味描述Table 2 The relative odor activity values and odor description of three kinds of black garlic vinegar

續 表

續 表

在對3種黑蒜醋各揮發性風味物質定性分析的基礎上，結合表1中各揮發性風味物質離子峰面積比，以ROAV為參數，確定3種黑蒜醋中關鍵揮發性風味物質。由表2可知，根據現已查到的閾值計算得出產品A，B，C中100≥ROAV≥1的組分各有11，7，8種；1>ROAV≥0.1的組分各有3，10，1種；0.1>ROAV的組分均為1種。

由表2可知，主要揮發性風味物質為酸類、酯類和醛類。乙酸是產品A和C中總體揮發性風味貢獻最大的物質；美拉德反應使戊糖降解形成的糠醛是產品B中總體揮發性風味貢獻最大的物質。對產品A，B，C總體揮發性風味貢獻較大的酯類主要為γ-壬內酯。除此之外，產品A的主要揮發性風味物質還有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、異戊醇、苯甲醇、苯乙醇、苯乙醛、3-羥基-2-丁酮；產品B的主要揮發性風味物質還有己酸乙酯、苯乙醇、3-羥基-2-丁酮、川芎嗪；產品C的主要揮發性風味物質還有乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、正壬醇、苯乙醛。辛酸乙酯和癸酸乙酯是產品A和B的揮發性風味的重要修飾物質；具有苦杏仁味的苯甲醛是產品A，B，C的揮發性風味的重要修飾物質。

2.3 不同產地黑蒜醋有機酸含量分析

對3種不同產地黑蒜醋有機酸含量進行分析，與標準有機酸混合溶液對照，產品A和B有9種有機酸，產品C有5種有機酸，見表3。

表3 3種黑蒜醋有機酸HPLC分析結果Table 3 The analysis of organic acids in three kinds of black garlic vinegar by HPLC g/L

由表3可知，產品A，B，C除乙酸外，還含有乳酸、草酸、檸檬酸等不揮發性酸。醋中大部分不揮發酸的沸點較高、黏性較大，可以降低醋中揮發性風味物質的揮發速度，緩沖乙酸的刺激性氣味[26]。產品A和B中乙酸、乳酸、蘋果酸的含量相對較高，是主要呈味有機酸。產品C與產品A和B存在明顯差異，乙酸含量為43.82 g/L，較產品A和B高10.31～19.79 g/L，其余有機酸含量均低于產品A和B。產品A中蘋果酸含量較乳酸含量高3.77 g/L，可能與發酵過程中總酸含量有關[27]。產品B中檸檬酸含量較產品A和C高1.85～1.99 g/L，可能是發酵過程易于積累檸檬酸。3種黑蒜醋中不揮發性酸的種類和含量不同，與生產過程中不同的原料和發酵工藝有關[28]，這些有機酸共同決定了黑蒜醋的酸味質量。

3 結論

3種黑蒜醋共鑒定出53種揮發性風味物質，其中酸類8種、酯類17種、醇類10種、醛類8種、酮類4種、酚類3種、雜環類2種和醚類1 種；其中共有的關鍵揮發性風味物質有乙酸、糠醛、γ-壬內酯和苯乙醇，共有的有機酸有乙酸、乳酸。二烯丙基二硫醚是產品A的重要特征風味物質；烘烤味的吡嗪類物質是產品B的重要特征風味物質；乙酸在產品C中含量最高，為43.82 g/L。

3種黑蒜醋各自獨特的發酵工藝使得呈味物質組成有所差異。從總體比較來看，產品A和B不論是從揮發性風味物質還是有機酸的組成及含量上來看均高于產品C。產品A中測得的二烯丙基二硫醚有明顯的蒜香味，且蘋果酸濃度較大；產品B中測得有烘烤味的吡嗪類物質，且乳酸濃度較大；產品C中測得的正壬醇有橙香味，且乙酸濃度最高。