響應(yīng)面法優(yōu)化高粱紅色素提取工藝的研究

米智,劉荔貞，武曉紅

(1.山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西 大同 037009)

高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench)是一年生草本植物，禾本科高粱屬，具有雜種優(yōu)勢(shì)明顯、抗逆性強(qiáng)、光合作用效率高、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)[1]。高粱是世界上第五大谷類(lèi)作物，我國(guó)是世界高粱主產(chǎn)國(guó)之一，種質(zhì)資源十分豐富[2]。傳統(tǒng)釀酒和制醋工業(yè)均采用高粱種仁為原料，故高粱每年種植面積約為133.3萬(wàn)公頃，高粱殼大多成為加工廢棄物，進(jìn)而污染環(huán)境，年產(chǎn)量近200萬(wàn)噸[3]。高粱殼顏色多為紫紅色(紅高粱)和紫黑色(黑高粱)，因其紅色素含量較高而成為提取天然色素的重要原料，且具有成本低廉、原料來(lái)源穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[4]。

食用色素分為天然色素和合成色素，合成色素在人體代謝過(guò)程中可能產(chǎn)生一定的毒副作用，其發(fā)展受到制約；天然色素?zé)o毒無(wú)害、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有些還具有一定的生物活性[5-6]。高粱色素多以高粱紅色素為主，高粱黃色素偶爾也有提及[7]。

高粱紅色素是用熱水或乙醇從黑紫色或紅褐色高粱殼中提取的紅色色素，主要成分是異黃酮半乳糖苷，是一種天然食用色素，具有生津止渴、消炎解熱、擴(kuò)張血管、降低血糖和血壓的作用[8]。因其無(wú)毒、無(wú)明顯異味、價(jià)格低廉、染色性能好、色澤自然柔和等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)受到廣大學(xué)者的普遍關(guān)注和青睞[9-11]。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014規(guī)定[12]，高粱紅色素可用于多種食品的著色[13]。

本文以黑、紅高粱殼為研究材料，以酸性乙醇作為提取溶劑，采用響應(yīng)面方法分析探討索氏提取法提取高粱紅色素的最佳提取條件，為高粱殼提取色素、高粱紅色素的下游研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料

高粱：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)/山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；高粱紅標(biāo)準(zhǔn)品：南京松冠生物科技有限公司；乙醇、鹽酸等所有試劑均為分析純級(jí)別。

1.2 儀器與設(shè)備

索氏提取器、電子分析天平、數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱、pH計(jì)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、離心機(jī)、高速中藥粉粹機(jī)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)等。

1.3 方法

1.3.1 高粱處理及高粱紅色素提取工藝流程

1.3.1.1 高梁處理

選擇籽粒飽滿(mǎn)、外觀佳的高粱，脫殼后得到顏色較深的紅棕色或黑紫色高粱殼，經(jīng)風(fēng)選后除掉碎砂石等大顆粒雜質(zhì)，再用水沖洗掉漂浮物及沉淀下來(lái)的高粱粒和細(xì)沙土等，晾(烘)干備用。

1.3.1.2 高粱紅色素提取工藝流程

高粱殼→粉碎→稱(chēng)重→包裝→浸提→定容→離心→測(cè)定→計(jì)算得率或色價(jià)。

1.3.2 高粱紅色素色價(jià)的計(jì)算方法

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.32-2015《食品添加劑 高粱紅》[14]的方法，即：

式中：A為稀釋后試樣溶液的吸光值；n為稀釋倍數(shù)；m為高粱殼的質(zhì)量，g。

1.3.3 高粱紅色素提取工藝的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 乙醇濃度

準(zhǔn)確稱(chēng)取處理后的高粱殼3 g，在提取時(shí)間為2.0 h、提取液pH為3.0、料液比為1∶8(g/mL)時(shí)，將乙醇濃度分別設(shè)定為55%、60%、65%、70%、75%提取高粱紅色素，提取液的吸光值在500 nm處測(cè)定。

1.3.3.2 料液比

準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g處理后的高粱殼，在乙醇濃度為65%、提取液pH為3.0、提取時(shí)間為2.0 h的條件下，將料液比設(shè)定為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10(g/mL)提取高粱紅色素，并在500 nm處測(cè)定提取液的吸光值。

1.3.3.3 提取時(shí)間

準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g處理后的高粱殼，在乙醇濃度為65%、料液比為1∶8(g/mL)、提取液pH為3.0的前提下，設(shè)置提取時(shí)間為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h提取高粱紅色素，并在500 nm處測(cè)定提取液的吸光值。

1.3.3.4 提取液pH

準(zhǔn)確稱(chēng)取處理后的高粱殼3 g，在乙醇濃度為65%、提取時(shí)間為2.0 h、料液比為1∶8(g/mL)的條件下，將提取液pH值設(shè)定為2，3，4，5，6提取高粱紅色素，并在500 nm處測(cè)定提取液的吸光值。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

根據(jù)高粱紅色素提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果，從乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和溶劑pH(D)4個(gè)因素中，分別選取對(duì)高粱紅色素吸光值影響最大的3個(gè)水平，采用Design-Expert V8.0.7軟件，以500 nm處的吸光值為衡量指標(biāo)，根據(jù)四因素三水平建立響應(yīng)面試驗(yàn)。采用軟件中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，確定響應(yīng)面試驗(yàn)方案，并建立回歸方程和預(yù)測(cè)分析模型，確定高粱紅色素的最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.5 高粱紅色素提取工藝的驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了證實(shí)索氏提取法提取高粱紅色素的可靠性和合理性，每個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果樣品取3份，添加高粱紅色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，開(kāi)展平行驗(yàn)證試驗(yàn)，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱紅色素的提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同乙醇濃度對(duì)高粱紅色素吸光度的影響

圖1 乙醇濃度對(duì)高粱紅色素吸光度的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the absorbance of sorghum red pigment

由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度小于65%時(shí)，高粱紅色素的吸光值隨著乙醇濃度的增大而增大；當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，吸光值達(dá)到最大值，約為0.7；當(dāng)乙醇濃度超過(guò)65%時(shí)，高粱紅色素的吸光值隨著乙醇濃度的增大而減小。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中，分別選取60%、65%、70%的乙醇濃度作為3個(gè)水平。

2.1.2 不同料液比對(duì)高粱紅色素吸光度的影響

圖2 料液比對(duì)高粱紅色素吸光度的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the absorbance of sorghum red pigment

由圖2可知，高粱紅色素的吸光值隨著料液比的增大而提高，當(dāng)料液比為1∶8時(shí)，吸光值最大，約為0.69，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)繼續(xù)增大料液比時(shí)，高粱紅色素的吸光值隨著料液比的增大而降低。所以在進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇料液比為1∶7、1∶8和1∶9。

2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)高粱紅色素吸光度的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)高粱紅色素吸光度的影響Fig.3 Effect of extraction time on the absorbance of sorghum red pigment

由圖3可知，提取時(shí)間在1.0～2.5 h時(shí)，高粱紅色素的吸光值隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，且在2.5 h時(shí)，高粱紅色素的吸光值最大，約為0.73，僅比2.0 h時(shí)0.72略高，因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中，選取1.5，2.0，2.5 h的提取時(shí)間作為3個(gè)水平。

2.1.4 不同pH值對(duì)高粱紅色素吸光值的影響

由圖4可知，提取液pH值在2～3時(shí)，高粱紅色素的吸光值隨著pH的提高而增大，并在pH為3時(shí)吸光值最大，約為0.66；當(dāng)pH在3～6時(shí)，高粱紅色素的吸光值隨著pH值的提高反而降低，因此在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取pH值為2，3，4。

2.2 回歸模型的建立及其分析

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平的確定Table 1 The determination of factors and levels of response surface test

響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 The scheme and results of response surface test

續(xù) 表

建立高粱紅色素提取工藝參數(shù)的回歸模型，得到了評(píng)價(jià)指標(biāo)(高粱紅色素吸光值)的響應(yīng)值對(duì)自變量A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(提取時(shí)間)和D(提取液pH)的響應(yīng)值的二次多項(xiàng)式回歸方程：高粱紅色素吸光值OD500(Y)=0.81+0.038A+1.667E-003B+0.022C-0.037D-0.015AB-0.018AC+0.037AD-0.02BC+0.02BD+0.023CD-0.094A2-0.049B2-0.069C2-0.13D2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

以高粱紅色素吸光度的OD500 nm值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)模型進(jìn)行方差和顯著性分析檢驗(yàn)(見(jiàn)表3)，回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；由P值可以得到A、D、A2、B2、C2和D2對(duì)高粱紅色素吸光度的影響極顯著，表明試驗(yàn)中各因素及因素之間的交互和響應(yīng)值并不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大的影響，4個(gè)因素之間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響相對(duì)較小；失擬項(xiàng)的P值=0.5533>0.05，影響不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合良好，模型選擇較為合理，模型的殘差可能來(lái)自試驗(yàn)過(guò)程的隨機(jī)誤差。模型的修正決定系數(shù)RAdj2=0.8176，說(shuō)明高粱紅色素吸光值測(cè)定試驗(yàn)中81.76%的變異分布在方程的14個(gè)因子中，其總變異有18.24%不能由該模型來(lái)解釋?zhuān)琑2值為0.9088，說(shuō)明吸光值的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，該模型可用于預(yù)測(cè)高粱紅色素吸光值的實(shí)際情況。噪音信號(hào)比的比率(Adeq Precision)為12.303(>4)，說(shuō)明本模型能真實(shí)地反映試驗(yàn)結(jié)果；試驗(yàn)的精確度(C.V.)為5.61%，說(shuō)明試驗(yàn)操作可靠。由表3中的P值可知，各因素對(duì)高粱紅色素提取的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛?A)>提取液pH(D)>提取時(shí)間(C)>料液比(B)，其中乙醇濃度和提取液pH對(duì)高粱紅色素吸光值的影響極顯著(P=0.0033和P=0.0045，均小于0.01)[15]。

通過(guò)三維響應(yīng)面圖和二維等高線(xiàn)圖分析表明，隨著乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取液pH值的增加，高粱紅色素的吸收值也隨之增加，但當(dāng)這4個(gè)因素增加到一定程度時(shí)，高粱紅色素的吸收值呈下降趨勢(shì)，4個(gè)因素相互作用，對(duì)吸光度值的影響不顯著，而從等高線(xiàn)圖上看，橢圓度和密度也相當(dāng)，符合回歸分析模型的方差分析[16-17]。

2.3 最佳提取工藝條件的確定

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面法數(shù)據(jù)的分析，得出高粱紅色素的最佳提取工藝：乙醇濃度為65.87%，提取時(shí)間為2.06 h，提取液pH值為2.89，料液比為1∶7.94，高粱紅色素的吸光值為0.815。考慮到試驗(yàn)操作的可行性，對(duì)提取工藝進(jìn)行了改進(jìn)：乙醇濃度為65%，提取時(shí)間為2 h，提取液pH值為3.0，料液比為1∶8。

2.4 樣品加標(biāo)回收率及最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)3組樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得到回收率在96.52%～104.86%之間，說(shuō)明索氏提取法提取高粱紅色素準(zhǔn)確、可靠。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)篩選出高粱紅色素的最佳提取工藝，并進(jìn)行3組平行重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。驗(yàn)證性試驗(yàn)測(cè)定高粱紅色素吸光值分別為0.81，0.78和0.79。3組平行樣數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.65%，精密度和重復(fù)性均能滿(mǎn)足要求，得出該提取工藝高粱紅色素的吸光值較為穩(wěn)定。并在該條件下對(duì)高粱紅色素進(jìn)行粗提，提取率約為25.2%，色價(jià)約為27.1(≥25)，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

由響應(yīng)面和方差分析可知，索氏提取法從高粱殼中提取高粱紅色素的最佳工藝為提取時(shí)間2 h、料液比1∶8、乙醇濃度65%和提取液pH值為3.0。4個(gè)因素對(duì)提取率的影響程度為乙醇濃度>提取液pH>提取時(shí)間>料液比，乙醇濃度和提取液pH值對(duì)高粱紅色素吸光值的影響極顯著。樣品加標(biāo)回收率為96.52%～104.86%，RSD較小(2.65%)，說(shuō)明索氏提取法提取高粱紅色素工藝可靠、精準(zhǔn)。高粱紅色素的提取率約為25.2%，色價(jià)約為27.1(≥25)，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。響應(yīng)面試驗(yàn)可以對(duì)各種因素及其相互作用進(jìn)行更全面、詳細(xì)的分析，并能準(zhǔn)確分析出因素的最佳組合，使試驗(yàn)穩(wěn)定、可靠，為進(jìn)一步探究高粱紅色素的提取奠定了基礎(chǔ)。