正交法優(yōu)化超聲波提取橘皮果膠的工藝研究

李靚，朱涵彬，李長(zhǎng)濱，潘春梅，岳曉禹，王夢(mèng)蝶

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450046)

柑橘作為一種水果，因含有多種營(yíng)養(yǎng)成分、保健功效良好而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但在柑橘直接食用或加工生產(chǎn)中，產(chǎn)生約20%～50%果皮渣廢棄物，若用物理或化學(xué)方法處理，既可得到豐富的糖類(lèi)、維生素等高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值物質(zhì)，還可得到果膠[1]、精油[2]、色素[3]、黃酮[4]等生物活性物質(zhì)。橘皮還可應(yīng)用于低糖型風(fēng)味果醬的研制[5]，誘導(dǎo)酚類(lèi)抗氧化活性應(yīng)用于功能性醬油開(kāi)發(fā)等[6]，在食品、藥品及調(diào)味品等行業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。果膠作為食品添加劑被大量使用，若能從橘皮中快速提取優(yōu)質(zhì)果膠可將資源最大化利用。因此，研究?jī)?yōu)化果膠的提取工藝、提高其得率顯得尤為重要。

果膠提取方法主要有酸水解法、酶法、超聲波法及復(fù)合法等[7-11]。超聲波能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)果膠游離，使得提取速率加快。酸水解法將不溶性原果膠在酸作用下轉(zhuǎn)化為水溶性果膠，使得提取產(chǎn)量加大。因此，本文擬采用超聲波輔助酸法提取橘皮果膠，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化單因素提取條件從而提高果膠得率，為橘皮果膠的研究開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川青見(jiàn)柑橘皮：購(gòu)于鄭州市丹尼斯超市；95%乙醇：新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司；無(wú)水乙醇(AR)：萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；硫酸(AR)：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；氫氧化鈉(AR)：西安天茂化工有限公司；0.1 mol/L鹽酸：廣州和為醫(yī)藥科技有限公司；咔唑(AR)、半乳糖醛酸試劑(AR)：上海麥克林生化科技有限公司；緩沖溶劑等。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104型電子天平 上海力辰科技有限公司；DHG-9140型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī) 廣州康恒儀器有限公司；UV-759CRT型分光光度計(jì) 上海菁華科技有限公司；RHP-500A型粉碎機(jī) 浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司；SHZ-C恒溫水浴振蕩器 杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；3S型超聲波反應(yīng)器 江蘇江大五棵松科技有限公司；TDZ4-WS型離心機(jī) 河南攀之峰科技有限公司；PHS-25型酸度計(jì) 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；HH-6型恒溫水浴鍋 常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2016-2011對(duì)果膠進(jìn)行定量[12]。

在100 mL容量瓶中加入0.1000 g半乳糖醛酸試劑，加入0.5 mL 40 g/L NaOH溶液定容成濃度為1000 mg/L的溶液。吸取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分別放入25 mL容量瓶中，固定質(zhì)量濃度為0.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg/L的半乳糖醛酸溶液。

取1 mL不同濃度的半乳糖醛酸溶液放入比色管中，加入0.25 mL咔唑-乙醇溶液，再迅速加入5.0 mL濃硫酸后搖勻，80 ℃恒溫水浴振蕩器振蕩20 min。取出比色管待冷卻，用分光光度計(jì)在525 nm處測(cè)定不同濃度溶液的吸光度。以半乳糖醛酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，經(jīng)過(guò)3次試驗(yàn)得到擬合度最好的線性方程為y=0.0077x+0.0042，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9989。

1.3.2 操作步驟

將新鮮橘子剝皮后置于沸水中煮5～10 min，使可以分解果膠的酶失活。將煮后的橘皮用60 ℃水反復(fù)漂洗后置于80 ℃干燥箱中干燥6 h至恒重，再用粉碎機(jī)粉碎成細(xì)小粉狀于40目篩過(guò)篩即得橘皮粉末以備用。

取一定量粉末加蒸餾水后用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)，放置于超聲波反應(yīng)器中控制溫度和時(shí)間，取上清液過(guò)濾，將95%乙醇倒入濾液中攪拌，將離心機(jī)設(shè)置在4000 r/min，時(shí)間為0.25 h離心，將所得果膠在85 ℃下干燥即得果膠沉淀。將果膠沉淀加入0.5 mL 40 g/L NaOH溶液，定容至100 mL容量瓶中。

1.3.3 結(jié)果計(jì)算

取1 mL果膠稀釋液按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作，測(cè)定果膠稀釋液的吸光度并記錄結(jié)果。根據(jù)下式計(jì)算果膠提取率A，并保留四位有效數(shù)字。

式中：ρ為通過(guò)線性方程算出的稀釋液的半乳糖醛酸質(zhì)量濃度(mg/L)；V為果膠沉淀溶解并定容的體積(mL)；m為樣品的質(zhì)量(g)。

1.4 單因素試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)

通過(guò)設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，設(shè)置變量研究4個(gè)影響因素：料液比設(shè)置成5個(gè)水平(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，pH設(shè)置成5個(gè)水平(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5)，超聲溫度設(shè)置成5個(gè)水平(55，60，65，70，75 ℃)，超聲時(shí)間設(shè)置成5個(gè)水平(20，30，40，50，60 min)，探究各因素對(duì)橘皮果膠提取率的影響，平行3次試驗(yàn)取平均值。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以果膠提取率為結(jié)果指標(biāo)，選擇料液比、pH值、超聲溫度和超聲時(shí)間為考察因素，選取3個(gè)水平，用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，通過(guò)超聲波輔助酸法優(yōu)化橘皮果膠的提取工藝條件，得出果膠最大提取率，再確定最佳工藝條件，見(jiàn)表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最佳料液比的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1 g橘皮粉末，將料液比設(shè)定為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)，調(diào)整溶液pH值為1.5，在超聲溫度為70 ℃、超聲時(shí)間為40 min時(shí)取出離心。倒入95%乙醇取得果膠沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。測(cè)定幾次取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)果膠提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of pectin

由圖1可知，隨著料液比增大，吸光度呈先上升后下降的趨勢(shì)。在料液比為1∶15時(shí)，吸光度最大，為0.176，換算式果膠提取率為22.31%。這是由于料液比低于1∶15時(shí)，混合液比較黏稠，使得在過(guò)濾過(guò)程中比較困難，果膠可能濾出不完全，而其他果膠被留在殘?jiān)须y以濾出，從而導(dǎo)致提取率較低。當(dāng)料液低高于1∶15時(shí)，用乙醇沉淀時(shí)會(huì)導(dǎo)致濾出的果膠濃度較低，使其轉(zhuǎn)化成果膠的量也會(huì)減少。

2.1.2 最佳pH的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1 g橘皮粉末，加鹽酸調(diào)整溶液pH值分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，在料液比為1∶15、超聲溫度為70 ℃、超聲時(shí)間為40 min時(shí)取出離心。倒入95%乙醇取得果膠沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。測(cè)定幾次取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)果膠提取率的影響Fig.2 Effect of pH value on the extraction yield of pectin

由圖2可知，隨著溶液pH值的變化，吸光度呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溶液pH值在1.5時(shí)的吸光度比其他水平值高，得到果膠提取率最大，為22.28%。強(qiáng)酸(如鹽酸、硫酸等)使用有利于橘皮中原果膠溶解，但是酸度過(guò)低時(shí)會(huì)導(dǎo)致果膠內(nèi)部被破壞，從而降低果膠的提取率。

2.1.3 最佳超聲溫度的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1 g橘皮粉末，選擇料液比為1∶15、pH值為1.5時(shí)，按超聲溫度為55，60，65，70，75 ℃，超聲時(shí)間為40 min取出離心。倒入95%乙醇取得果膠沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。測(cè)定幾次取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著超聲溫度升高，吸光度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲溫度為70 ℃時(shí)，吸光度值最大，果膠提取率為22.53%。溫度的升高可加快果膠提取速率，若大于70 ℃，溫度過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致果膠分解，反而會(huì)使橘皮果膠的提取率下降。

2.1.4 最佳超聲時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1 g橘皮粉末，選擇料液比為1∶15、pH為1.5、超聲溫度為70 ℃時(shí)，設(shè)置超聲時(shí)間分別為20，30，40，50，60 min取出離心。倒入95%乙醇取得果膠沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。測(cè)定幾次取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of pectin

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間增加，吸光度呈先上升后下降的趨勢(shì)。在超聲時(shí)間為40 min時(shí)，吸光度值最大，果膠提取率為22.38%。當(dāng)超聲時(shí)間在20～40 min，由于超聲時(shí)間過(guò)短，使果膠不能充分地溶解到溶劑中；當(dāng)超聲時(shí)間大于40 min時(shí)，果膠分子結(jié)構(gòu)在長(zhǎng)時(shí)間作用下發(fā)生分解變性使果膠提取率降低。因此，要控制好超聲時(shí)間，防止果膠發(fā)生降解。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析表

由表2中極差R值大小可知，B(pH)對(duì)果膠得率的影響最大，A(料液比)對(duì)果膠得率的影響最小。因素影響效果由大到小為：B(pH)>C(超聲溫度)>D(超聲時(shí)間)>A(料液比)。

又由于A列中K2>K1>K3；B列中K2>K1>K3；C列中K2>K3>K1；D列中K2>K3>K1。因此，經(jīng)正交試驗(yàn)獲得的最優(yōu)方案為B2C2D2A2，即在超聲溫度70 ℃、pH 1.5、超聲時(shí)間40 min、料液比1∶15的條件下獲得較多的果膠。

表3 方差分析表

由表3可知，P<0.05說(shuō)明具有顯著性，P<0.01說(shuō)明非常具有顯著性，因此料液比對(duì)果膠提取率具有顯著性影響，而pH、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)果膠提取率具有非常顯著性影響。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)中得到的最優(yōu)方案為B2C2D2A2，即工藝條件：料液比為1∶15，pH值為1.5，超聲溫度為70 ℃，超聲時(shí)間為40 min。以最優(yōu)方案B2C2D2A2進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，橘皮果膠提取率分別為22.42%、22.33%、22.54%，平均的提取率為22.43%。由于這3次結(jié)果均大于正交試驗(yàn)中的結(jié)果(最大為20.05%)，確定此試驗(yàn)結(jié)果的合理性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用四川青見(jiàn)柑橘，通過(guò)超聲波輔助酸提取法從橘皮中提取果膠，在單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化后得到最佳工藝條件為：pH 1.5，超聲溫度70 ℃，超聲時(shí)間40 min，料液比1∶15，此時(shí)果膠提取率最大，為22.43%。4個(gè)因素的影響順序?yàn)椋簆H>超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比。該試驗(yàn)方法條件易控制，成本較低，提取效果好。

通過(guò)本試驗(yàn)研究，為橘皮果膠提取提供了理論依據(jù)，同時(shí)為綜合利用橘皮副產(chǎn)物在其他領(lǐng)域應(yīng)用提供了理論參考[13]，如柑橘醋類(lèi)黃酮化合物生物技術(shù)研究[14]、橘皮發(fā)酵汁抗氧化性及風(fēng)味成分研究[15]，為柑橘副產(chǎn)物的多元化、功能化發(fā)展提供了技術(shù)支撐，增強(qiáng)了柑橘產(chǎn)業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和經(jīng)濟(jì)效益。