副干酪乳桿菌LPC-F通過促進Cajal間質細胞增殖緩解便秘

王琳琳，楊樹榮，王嘉良，王剛，張灝，趙建新，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

便秘是一種復雜的胃腸道功能障礙綜合征。主要癥狀為自發排便次數減少、排便困難、大便干硬、排便量少。便秘的發生率相對較高，據統計，全世界兒童便秘的發生率為0.5%～29.6%，成人便秘的發生率為2.6%～31%，老年人便秘的發生率為4.4%～ 44.5%[1]。研究表明便秘與腸道微生物群之間存在很強的相關性。與野生型小鼠相比，無菌小鼠腸蠕動明顯弱于野生型小鼠，將SPF級小鼠糞便移植給無菌鼠后，腸蠕動能力顯著提高[2]，這說明腸道菌群與腸蠕動有非常密切的關系。將便秘人群的糞便移植給無菌鼠后，無菌鼠結腸的平滑肌變弱，腸蠕動能力減弱[3]。上述結果進一步闡明了腸道菌群異常與便秘之間存在密切聯系。便秘患者中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度與正常人有較大差異[4]。

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)是一種廣泛存在于人腸道以及奶酪、泡菜等發酵食品中的益生菌，是維持人類微生態平衡的重要成員。前人的研究[5]發現副干酪乳桿菌LC-01，NTU 101及LC19均能不同程度的緩解由洛哌丁胺誘導的小鼠便秘癥狀。同時熱滅活的副干酪乳桿菌LC19也具有良好的緩解便秘的效果。上述的研究都僅限于副干酪乳桿菌是否具有緩解便秘作用這種療效指標上，并未對其緩解便秘的機制進行解析?；诖耍疚倪x取不同來源的對便秘具有不同緩解效果的2株副干酪乳桿菌(健康成人糞便和泡菜)，對其進行緩解便秘的可能機制的解析，主要研究內容包括：考察不同來源的2株副干酪乳桿菌對小鼠便秘癥狀的緩解情況；從c-kit基因、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)、神經遞質[5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、P物質]、腸道病理損傷、炎癥因子以及腸道菌群等檢測指標，進一步探究副干酪乳桿菌改善便秘的相關作用途徑；應用相關性分析的方法，建立腸道菌群和短鏈脂肪酸間的相關性，最終確定副干酪乳桿菌緩解便秘的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

免疫組化試劑盒，生物工程(上海)股份有限公司；小鼠c-kit蛋白抗體，北京博奧森生物技術有限公司；小鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒，武漢酶免生物科技有限公司；鹽酸洛哌丁胺(2 mg)，西安楊森制藥有限公司；小鼠5-HT、小鼠P物質(SP)ELISA試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、硫酸、無水乙醇、無水乙醚、無水硫酸鈉、甲醇、30%過氧化氫，國藥集團化學試劑公司。

活性炭溶液的配制：將阿拉伯膠100 g與水800 mL用玻璃棒混合均勻，放置于紅外爐上煮沸至溶液透明，加入活性炭50 g，煮沸后取下，待混合液稍冷卻再繼續煮沸，重復3次，制成活性炭懸濁液。溶液冷卻后，用水稀釋至1 000 mL，貯存于4 ℃，用前搖勻。

1.1.2 實驗菌株

將保存于-80 ℃冰箱中的菌株取出，以2%的接種量接種至MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養箱中培養24 h。連續活化2代后，以同樣接種量接種至900 mL MRS液體培養基中進行擴培，同樣條件培養后，將菌液以8 000×g離心15 min，棄上清液，得副干酪乳桿菌菌泥。用預冷生理鹽水清洗菌泥，以7 000×g離心15 min，棄上清液，重復清洗3次，獲得干凈的菌泥。配制30%(體積分數)甘油，并按照菌泥∶30%甘油=1∶1(g∶mL)將甘油與菌泥混合均勻后進行分裝，貯存于-80 ℃冰箱中。每隔7 d對菌液進行活菌計數，結果表明凍存1個月不會引起副干酪乳桿菌活菌數量級的變化，因此動物實驗中每月制備1次菌液。

在灌胃當天，取出凍存的菌液，以6 000 r/min離心5 min，棄上清液，獲得菌泥，用生理鹽水清洗，以6 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復清洗3次，獲得干凈的菌泥。向菌泥中添加一定體積的3%蔗糖溶液，使菌液濃度達到109CFU/mL，混合均勻后置于冰上備用。實驗中所用的2株副干酪乳桿菌均來自江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心，見表1。

表1 實驗用菌株Table 1 Experimental strains

1.1.3 動物實驗

動物實驗選用40只6周齡BALB/c雄性小鼠，購自南京模式動物研究所，飼養于江南大學實驗動物中心(許可證編號：SYXK2016-0045)的屏障環境中[室內溫度(25±2)℃；濕度(50±5)%；晝夜循環12 h]。實驗過程嚴格遵守江南大學實驗動物中心相關管理規定，小鼠在飼養期間飼喂標準飼料，自由飲水。將所有小鼠隨機分為空白組、模型組、副干酪乳桿菌LPC-F組和LPC-V干預組，每10只隨機分為1組，共計4組。動物實驗主要包括適應期、干預期與造模期，共計45 d。第1～7天為適應期，小鼠進駐動物房后適應性飼養1周。從第8～28天，每天8:00正常對照組、便秘模型組灌胃0.2 mL 3%蔗糖溶液、菌處理組灌胃相應的3%蔗糖溶液重懸的菌懸液(5×109CFU/mL)0.2 mL。從第29～37天，每天上午，模型組、菌處理組灌胃0.2 mL鹽酸洛哌丁胺懸液(10 mg/kg BW)，正常組灌胃0.2 mL蒸餾水，1 h后，正常組、模型組灌胃0.2 mL 3%蔗糖溶液，不同菌處理組灌胃0.2 mL 相應的3%蔗糖溶液重懸的菌懸液(5×109CFU/mL)。實驗期間各組小鼠均飼喂標準維持飼料，從第0天開始，每周收集1次小鼠糞便，并于最短時間內保存于-80 ℃冰箱。實驗結束后(第45天)，按0.05～0.1 mL/10 kg，采用1%戊巴比妥鈉溶液對小鼠進行腹腔注射，用鑷子進行眼部靜脈叢采血，采血完畢后脫頸椎處死。收集到的血液在室溫條件下靜置2 h，3 000×g條件下離心10 min，將血清進行分裝，-80 ℃凍存備用，實驗分組見表2。

表2 動物實驗分組Table 2 The group of animal experiment

1.1.3.1 排首粒黑便時間檢測

實驗第37 天，進行小鼠排首粒黑便時間測定。模型組小鼠和菌處理組小鼠灌胃0.2 mL鹽酸洛哌丁胺懸液，正常組小鼠灌胃0.2 mL蒸餾水，1 h后，各組每只小鼠灌胃0.2 mL上述的活性炭溶液，記錄每只小鼠灌胃結束后的時間，并將其放入干凈的籠盒中，等其排出首粒黑便，然后記錄排出黑便時所對應的時間。如上2個時間段的間隔時間即為排首粒黑便時間。

1.1.3.2 小腸推進率檢測

實驗最后1 d，對小鼠小腸推進率進行測定。第37天19:00禁食不禁水過夜，第38天8:00，便秘模型組和菌處理組小鼠灌胃0.2 mL鹽酸洛哌丁胺懸液，正常組灌胃0.2 mL蒸餾水，1 h后，按照相應的順序對每組小鼠灌胃活性炭溶液。30 min后用戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，對小鼠進行眼眶采血后，斷頸犧牲。輕輕剪開小鼠腹腔，取出從幽門至盲腸段，用鑷子在測量尺上拉直，記錄小腸全長和活性炭前沿至幽門的距離。小腸推進率計算如公式(1)所示：

(1)

1.1.3.3 糞便含水量檢測

每周上午8:00收集糞便，方法如下：先給每只小鼠灌胃鹽酸洛哌丁胺，1 h后將小鼠分別單獨放置在事先墊有濾紙的干凈籠盒中，從放入籠盒的時刻開始計時，6 h后將小鼠輕輕放回飼養籠盒，期間收集每只小鼠的糞便。將收集到的糞便裝入事先滅菌的1.5 mL EP管中，然后將EP管置于冰盒中保存。收集到的糞便經冷凍干燥后，記錄糞便的干重，糞便的含水量計算如公式(2)所示：

(2)

1.1.3.4 血清中炎癥相關指標及結腸組織中便秘相關胃腸調節肽的檢測

小鼠血清用于檢測TNF-α、IL-1β的濃度。檢測方法參照相應ELISA試劑盒說明書進行。結腸組織用于5-HT、SP的檢測。使用預冷的生理鹽水輕輕沖洗結腸組織，去除組織中殘留的雜質和周圍的脂肪，剪取適當質量的結腸組織，準確稱重，按照組織∶生理鹽水=1∶9(g∶mL)的比例加入預冷的生理鹽水，使用高通量組織研磨器，以70 Hz/s的頻率研磨30 s，共振蕩4次，直至組織不存在肉眼可見的大顆粒物質。12 000×g、4 ℃離心15 min，分裝上清液，按照5-HT、SP的ELISA試劑盒說明書進行測定。

1.1.3.5 結腸組織中c-kit蛋白免疫組化

通過免疫組化染色評估結腸組織中c-kit蛋白，按照免疫組化試劑盒進行實驗。具體操作步驟如下：(1)為防止組織脫片，烤片時間縮短為1 h;(2)不同濃度的乙醇進行梯度水化時，將水化時間由3 min提高至5 min。封片后，經自然風干，用無水乙醇或二甲苯擦去多余樹膠，用切片掃描儀進行觀察拍照。免疫組化結果使用Image J軟件結合IHC profile插件對免疫組化切片陽性表達面積進行統計。每個切片隨機選取6個區域進行統計。

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-qPCR)來測定c-kit基因轉錄水平。取超低溫冰箱凍存新鮮結腸組織，按說明書用Trizol法提取總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書方法合成cDNA。c-kit基因、GAPDH基因引物序列如表3所示。RT-qPCR反應體系共10 μL。反應條件為：95 ℃，2 min；95 ℃，30 s；59 ℃，30 s；72 ℃，20 s；共35個循環。以GAPDH基因為內參基因，CFX96Manager軟件分析結果。

表3 c-kit基因、GAPDH基因引物序列Table 3 Primer sequence of c-kit gene and GAPDH gene

1.1.3.6 糞便中SCFAs檢測

參考毛丙永[6]的方法采用GC-MS測定小鼠糞便中SCFAs含量，將收集到的糞便經凍干、浸泡、酸化、乙醚萃取并脫水后利用Thermo氣質聯用儀測定SCFAs的含量。

1.1.3.7 糞便菌群檢測

糞便DNA提取是按照Fast DNA SPIN Kit for Feces試劑盒標準流程操作。具體操作步驟如下：

(1)提取糞便樣品中總DNA

應用MP糞便樣品基因組提取試劑盒Fast DNA SPIN Kit for Feces，提取總DNA。

(2)16S rDNA可變區(V3～V4區)擴增

以糞便基因組為模板，以正向引物341F(5′- CCT AYG GGR BGC ASC AG-3′)、反向引物802R (5′- GGA CTA CNN GGG TAT CTA AT-3′)為引物，擴增16S rDNA V3～V4區片段，不同樣品用7個堿基組成的barcode進行區分，并加在上游引物341F的5′端，其中目的片段長度約為465 bp左右。

(3)PCR產物切膠回收

按照 QIAquick Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒說明書進行目的條帶膠回收。

(4)混樣、構建文庫以及Illumina Miseq平臺測序

參照TruSeq Nano DNA LT Sample Prep Kit建庫試劑盒的說明書構建文庫，完成末端修復、3′端加A、接頭連接以及PCR擴增等一系列步驟。文庫質控采用Agilent Bioanalyzer 2100生化分析儀測定DNA片段的分布情況，qPCR精確定量文庫中DNA的質量濃度(ng/μL)。最后參照測序試劑盒MiSeq Reagent Kit v3的說明書將文庫加至Reagent Kit Cartridge中，放入MiSeq測序儀中開始上機測序。

(5)下機數據質量控制

質控方法參考文獻[7]。測序完成后，根據引物Barcode特異性拆分文庫中對應樣品的原始序列，過濾掉barcode和引物序列、低質量堿基序列(質量得分< 30)，序列小于200 bp的序列和錯配序列。過濾后的序列在QIIME軟件進行正反向序列拼接，要求最小重疊區域為10 bp、重疊區域的最大錯配比率為0.2、去除嵌合體序列，最終得到高質量拼接序列。采用VSEARCH軟件對得到的優質拼接序列進行uclust聚類分析，根據序列相似性生成大量的操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，相似度 ≥ 97%的可認為是1個OTU。RDP classifier軟件對OTUs代表序列進行分類學分析，與Silva參考數據庫比對注釋，得到微生物在不同水平上的分類學信息，進一步分析樣本的α多樣性和β多樣性。Alpha多樣性指數包括Chao 1、Simpson指數。FastTree軟件構建OTU代表序列的系統發育樹，進行層次聚類，計算樣品間的UniFrac距離分析樣品間相似性和差異性，體現不同樣本微生物組成和群落結構差異(β多樣性)。結合OTU的分類和豐度，進一步計算weighted Unifrac和unweighted Unifrac距離。

1.1.4 統計分析

本論文中，數據統計學方法均用“平均值±標準差”(mean±SD)，使用GraphPad Prism 9.0版進行繪圖。采用SIMCA、OmicShare tool在線繪圖網站、Past3進行主成分分析(principal component analysis，PCA)繪圖。使用SPSS(22版)進行One-Way ANOVA單因素方差分析及相關性分析。采用Duncan進行事后檢驗。對各組數據的差異進行分析，以不同字母標注表示有顯著差異(P<0.05)。通過PCA，中心對數比(clr)變換的屬水平計數表以及方差的排列多變量分析(perMANOVA)對β多樣性進行了評估。通過線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)效應大小(LDA effect size,LEfSe)區分微生物生物標志物(lgLDA>2.0作為閾值)。采用TSS方式對數據進行標準化，并在MicrobiomeAnalyst中分析α多樣性和LEfSe(https://www.microbiomeanalyst.ca/faces/home.xhtml)。

2 結果與分析

2.1 副干酪乳桿菌LPC-F 具有緩解便秘的作用

由圖1可知，小鼠灌胃洛哌丁胺后，糞便含水量和小腸推進率顯著下降，排首粒黑便時間顯著增加，表明便秘模型造模成功。應用不同的副干酪乳桿菌干預后，LPC-F組顯著改變了便秘相關的指標，而LPC-V組僅對排首粒黑便時間有效，結合《保健食品評價技術規范》中有關緩解便秘陽性結果的評價標準，提示L.paracaseiLPC-F具有緩解便秘的作用。以往的研究發現青春雙歧桿菌在緩解便秘方面具有種間差異，其產生差異的原因可能與菌株的黏附特性及菌株的生長速率相關[8]。因此下一步可以從菌株的生理特性方面去分析這2株副干酪乳桿菌在緩解便秘方面具有差異的可能原因。

a-糞便含水量；b-小腸推進率；c-首粒黑便時間圖1 副干酪乳桿菌對小鼠便秘相關指標的影響Fig.1 The effect of L. paracasei on constipation-related indicators in mice 注：#, 模型組與正常組之間具有顯著性差異, 其中#表示P<0.05,###P<0.005, ####P<0.001； *,菌干預組之間或菌干預組與模型組之間具有顯著性差異,其中*表示P<0.05,**P<0.01,***P<0.005,****P<0.001; ns, 兩組間無顯著差異(下同)

2.2 副干酪乳桿菌LPC-F可降低小鼠的炎癥水平

IL-1β可以引導炎癥細胞進入病變部位，促進血管白細胞黏附分子的表達，引起炎癥反應[9]。而TNF-α主要在炎癥初期誘導多種細胞產生其他炎癥因子，產生重要的協同作用。在本研究中(圖2)，模型組小鼠血清中的TNF-α和IL-1β的水平顯著升高(P<0.05)，證明便秘同時也伴有低水平的炎癥，這與MACKOS等[10]的發現相一致。相較于模型組，2株副干酪乳桿菌均能顯著下調促炎因子TNF-α和IL-1β的水平(P<0.05)，改善了便秘所引起的機體的炎癥水平。乳桿菌在緩解炎癥，調節機體TNF-α水平方面的研究很多，且相關菌株調節免疫系統的功能也得到驗證。例如羅伊乳桿菌BM36301可降低老年鼠體內TNF-α水平[11]，也有研究指出副干酪乳桿菌能降低宿主TNF-α的水平[11]，這與本研究中副干酪乳桿菌可緩解便秘所引起的機體炎癥水平的結果相一致。結合2株副干酪乳桿菌對便秘相關指標的影響情況，可知L.paracaseiLPC-F在緩解便秘的同時，下調了機體的炎癥水平，而L.paracaseiLPC-V雖能下調機體的炎癥水平，但對便秘無緩解作用。因此，下調炎癥因子水平可能不是2株副干酪乳桿菌具有緩解便秘差異的原因。

a-SP；b-TNF-a圖2 副干酪乳桿菌對小鼠血清中炎癥因子水平的影響Fig.2 The effect of L.paracasei on levels of inflammatory factors in mice

2.3 副干酪乳桿菌LPC-F可提高結腸組織中胃腸調節肽5-HT和SP的水平

有關5-HT對腸動力影響的研究已超過50余年[12]，臨床上已有5-HT4受體激動劑(商品名：西沙比利)作為促動力藥用于治療便秘。因此本文對結腸內5-HT的水平進行了檢測(圖3)，模型組5-HT的水平顯著下調，這與先前的研究結果一致[13]。LPC-F組小鼠結腸中5-HT的水平顯著高于模型組，提示L.paracaseiLPC-F進入宿主體內后，可以通過其自身的代謝產物或者通過改善腸道菌群的組成提高宿主體內5-HT的水平，從而緩解結腸動力減弱的癥狀。然而也有研究發現，不同類型的便秘患者5-HT的變化趨勢截然不同[14]，這可能是因為5-HT需要通過激活相應的5-HT受體才能發揮作用。同時，受血清素轉運蛋白(serotonin transporter，SERT)的影響，5-HT可被轉運滅活，從而終止反應[14]。這就提示我們僅測量組織中5-HT的水平，還不夠準確，還需要測定腸道中5-HT受體及SERT表達情況，才能更加準確的解析L.paracaseiLPC-F對5-HT信號分子相關通路的影響情況。

SP是胃腸道一種重要的興奮性神經遞質，研究表明，腸道菌群會影響宿主體內SP的水平[15]。模型組小鼠結腸SP水平顯著低于正常組小鼠。LPC-F組小鼠結腸中SP的水平顯著高于模型組，提示L.paracaseiLPC-F緩解便秘可能與其上調宿主體內SP水平有關。

a-SP;b-5-HT圖3 副干酪乳桿菌對小鼠血清中胃腸動力調節激素水平的影響Fig.3 The effect of L.paracasei on levels of gastrointestinal motility hormone in mice serum

2.4 副干酪乳桿菌LPC-F顯著提高了結腸Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal, ICC)的數量

已有大量文獻證明，ICC數量的減少以及形態變化是導致胃腸道功能障礙的原因之一。酪氨酸激酶受體蛋白c-kit蛋白與ICC的功能密切相關，敲除c-kit將導致ICC失去功能，因此，可以將c-kit作為ICC的標記物[16]。免疫組化染色結果如圖4所示，模型組小鼠c-kit蛋白陽性信號強度弱于正常組小鼠，提示模型組小鼠ICC的數量顯著低于正常組小鼠。LPC-F組小鼠結腸中c-kit蛋白的陽性信號較強，呈較深的黃棕色，提示LPC-F組小鼠ICC數量高于模型組。由于免疫組化染色只能進行樣品的半定量，于是本研究進一步對c-kit基因轉錄水平進行測定，結果如圖4-b所示，模型組小鼠結腸c-kit基因的相對表達量下調，LPC-F組小鼠結腸中c-kit基因轉錄水平顯著高于模型組，提示L.paracaseiLPC-F 緩解便秘的同時促進了ICC數量的恢復。

2.5 副干酪乳桿菌LPC-F提高糞便中乙酸、丙酸水平

SCFAs是腸道細菌發酵多糖產生的重要代謝產物。本研究主要針對3種腸道中含量較為豐富的SCFAs展開測定，結果如圖5所示。模型組小鼠糞便中的乙酸、丙酸、丁酸的含量顯著下降(P<0.05)。臨床研究也發現，便秘患者糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量較正常人也有顯著下調的現象[17]，這與我們的研究結果相一致。L.paracaseiLPC-F干預后，小鼠糞便乙酸、丙酸的含量顯著高于模型組，提示L.paracaseiLPC-F緩解便秘可能與其糞便中乙酸、丙酸的含量相關。有文獻指出，乙酸可以刺激結腸釋放5-HT，使得結腸蠕動增加1倍[18]。結合L.paracaseiLPC-F緩解便秘及對5-HT的影響，推測L.paracaseiLPC-F可能通過提高結腸中乙酸、丙酸的含量，從而刺激腸嗜鉻細胞分泌5-HT促進排便。

a-免疫組化染色；b-c-kit相比表達量圖4 副干酪乳桿菌對ICC數量的影響Fig.4 The effect of L.paracasei on the number of ICC

a-乙酸；b-丙酸；c-丁酸圖5 副干酪乳桿菌對小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響Fig.5 The effect of L.paracasei on short-chain fatty acids in mice feces

2.6 副干酪乳桿菌LPC-F對便秘小鼠腸道菌群的影響具有其獨特性

腸道菌群通過黏附在腸黏膜上，形成了又一類腸道屏障——生物屏障[19]。一方面，生物屏障與宿主存在共生關系，兩者之間能夠進行營養物質、激素以及信號分子的傳遞，參與調控腸道免疫系統。另一方面，這些腸道菌群能夠抵抗致病菌的侵襲與傷害，維持菌群生態平衡。根據已有研究，便秘的發生與腸道菌群的紊亂相關，同時，恢復腸道菌群穩態有益于緩解便秘[19]。因此，探究便秘患者腸道菌群的變化與雙歧桿菌對腸道菌群的影響是十分必要的。

2.6.1 對腸道菌群多樣性的影響

本研究通過Chao1指數及Simpson指數衡量各組小鼠糞便菌群的α-多樣性。Chao 1指數如圖6-a、圖6-b所示, 便秘小鼠糞便菌群的Chao1指數顯著下降而Simpson指數顯著上調(P<0.05)，這表明洛哌丁胺作用后，小鼠糞便中微生物的豐富度減小，糞便中可觀測到的微生物種類變少。2株副干酪乳桿菌干預后小鼠糞便菌群Chao1指數顯著高于模型組小鼠，提示2株副干酪乳桿菌可以顯著提高糞便中物種的豐富度。

研究證實，便秘人群腸道菌群β-多樣性顯著區別于正常人群[4]。本研究也同樣考察了小鼠腸道菌群β-多樣性，根據Bray-Curtis距離進行主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)，組間比較采用多元方差分析,結果如圖6-c所示，PCoA圖顯示模型組小鼠的數據點和正常組小鼠的數據點出現了較大的偏移，說明洛哌丁胺對小鼠糞便菌群結構已產生了極為顯著的影響。LPC-F組的β-多樣性與模型組有偏差，而LPC-V的β-多樣性與模型組相似。

a-副干酪乳桿菌對小鼠糞便菌群Chao 1指數的影響; b-副干酪乳桿菌對小鼠糞便菌群Simpson指數的影響; c-副干酪乳桿菌對小鼠糞便菌群β-多樣性的影響圖6 副干酪乳桿菌對小鼠糞便菌群多樣性的影響Fig.6 The effect of L.paracasei on the diversity of intestinal microbiota in mice

2.6.2 對腸道菌群在門水平上的影響

門水平上(圖7-a)，主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria和Actinobacteria 4個門組成。洛哌丁胺作用后，小鼠糞便中Bacteroidetes相對豐度下降12%左右，而Firmicutes的相對豐度則相對應提高12.8%左右。模型組小鼠腸道菌群中Verrucomicrobia的相對豐度也顯著提高，這與BOUDREAU等[20]在長期灌胃蘆薈大鼠中觀察到的結果一致。模型組小鼠糞便中Deferribacteres相對豐度是正常組小鼠的3倍之多。在LI等[21]的研究中也發現便秘小鼠糞便中Deferribacteres相對豐度有上調的現象。副干酪乳桿菌干預后逆轉了便秘所引起的Bacteroidetes與Firmicutes相對豐度的改變，而腸道微生物群組成改變的一大主軸是沿著擬桿菌門-厚壁菌門軸進行的，擬桿菌門/厚壁菌門的結果與α-多樣性可能存在一定相關性[22]。

2.6.3 對腸道菌群在屬水平上的影響

進一步對小鼠糞便菌群數據展開LEfSe分析，得到了在小鼠腸道中具有統計學差異的生物標識(biomarker)(LDA值>2)。結果如圖7-b所示，模型組腸道菌群的特征屬為Ruminococcus和Allobaculum。LPC-F組的特征屬為Lactobacillus、Bacteroides及Akkermansia。而LPC-V組的特征屬為Anaeroplasma。

根據LEfSe分析結果，對相關屬的細菌相對豐度進行匯總統計，結果如圖8-a所示，便秘小鼠糞便菌群中Lactobacillus和Ruminococcus的相對豐度顯著上升，而Staphylococcus和Adlercreutzia的相對豐度則顯著下調。LPC-F干預后，圖8-a中的8個屬的相對豐度都有不同程度的上升或下降，從而導致其腸道菌群代謝產物SCFAs的水平發生變化，尤其是乙酸和丙酸的含量發生變化?；诖?，建立便秘是否緩解的指標(糞便含水量、小腸推進率、排首粒黑便時間)與炎癥因子、便秘相關胃腸調節肽(5-HT，SP)、SCFAs、c-kit之間相關性分析，同時建立菌群與SCFAs之間的相關性分析，結果分別如圖8-b,圖8-c所示，乙酸、丙酸和丁酸的含量與糞便含水量、小腸推進率呈正相關，而與排首粒黑便時間呈負相關；IL-1β則與糞便含水量、小腸推進率呈負相關，而與排首粒黑便時間呈正相關。5-HT與糞便含水量呈正相關，而與排首粒黑便時間呈負相關。c-kit及SP僅與排首粒黑便時間呈負相關。乙酸與Staphylococcus和Adlercreutzia的相對豐度呈正相關，而與Oscillospira,Anaerostipes,Ruminococcus及Akkermansia的相對豐度呈負相關。丙酸與Staphylococcus和Adlercreutzia的相對豐度呈正相關，而與Anaerostipes，Ruminococcus及Akkermansia的相對豐度呈負相關。這就說明腸道菌群結構的改變，導致代謝產物乙酸、丙酸含量發生變化。而我們前期研究發現乙酸具有緩解便秘的作用[23]。結合本文的結果可知L.paracaseiLPC-F緩解便秘的可能機制是：L.paracaseiLPC-F通過改變腸道菌群的結構，提高腸道內乙酸的水平，乙酸通過刺激腸嗜鉻細胞釋放5-HT，釋放入腸腔的5-HT通過與其受體相結合，促進ICC的增殖，從而最終增強腸蠕動緩解便秘。

a-門水平上的影響；b-LEfSe分析圖7 副干酪乳桿菌對小鼠糞便菌群的影響Fig.7 The effect of L.paracasei on relative abundance of bacteria

a-副干酪乳桿菌對腸道菌群屬水平相對豐度的影響;b-便秘緩解指標與檢測指標之間相關性分析；c-SCFA與腸道菌群之間相關性分析圖8 干酪乳桿菌對腸道菌群的影響及指標間相關性分析Fig.8 The effect of L.paracasei on relative abundance of intestinal microbiota and the correlation analysis among indicators

3 結論

本研究主要針對2株不同來源的副干酪乳桿菌，研究其緩解便秘的可能機制。通過應用洛哌丁胺構建便秘模型，及對便秘相關指標的檢測，發現來源于健康成人糞便的L.paracaseiLPC-F具有緩解便秘的作用。通過對便秘相關胃腸調節肽、血清中炎癥因子、ICC的數量、腸道菌群及其代謝產物SCFAs等指標進行檢測，并進一步建立腸道菌群與便秘檢測指標之間的相關性研究，以解析L.paracaseiLPC-F緩解便秘的可能途徑。結果表明，L.paracaseiLPC-F可能通過改變腸道菌群的結構，提高腸道內乙酸的水平，乙酸通過刺激腸嗜鉻細胞釋放5-HT，釋放入腸腔的5-HT通過與其受體相結合，促進ICC的增殖，從而最終增強腸蠕動緩解便秘。