酵母衍生物在果酒中的應用進展

陳曉姣，刁體偉，賴曉琴，冷銀江，魏鑫，馬懿

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644005)

酵母衍生物是通過在富含糖的培養基中培養釀酒酵母，之后通過自溶、質壁分離、水解等過程，再經過濃縮或干燥處理獲得的商業酵母制劑[1]。根據生產工藝、成分以及純化程度的不同，酵母衍生物可分為四類：滅活的干酵母、酵母自溶物、酵母細胞壁、酵母提取物[2]；根據酵母衍生物在果酒中的應用不同可分為：酒精發酵促進劑、乳酸發酵促進劑及果酒品質改良劑[3]；根據酵母衍生物釋放的功能性物質不同主要可分為富含谷胱甘肽(glutathione，GSH)及富含甘露蛋白兩大類[1]。

酵母衍生物制劑在釀酒過程中的應用，主要包括以下幾個方面：促進發酵進程，提高果酒中酒石酸鹽和蛋白質的穩定性；除去部分不理想的酒類成分[3]；含有來源于酵母的硫化合物，能作為抗氧化劑應用到果酒釀造中[4]；縮短果酒陳釀時間及提高果酒品質[5]。表1依據酵母衍生物在果酒中的不同功能列舉了商業酵母衍生物在釀酒行業的應用情況舉例及作用說明。

1 酵母衍生物釋放的功能性物質及其作用

在果酒釀造中，酵母衍生物因多糖含量高、富含多肽成分等具有廣闊的應用前景[2]。其釋放的眾多化合物中，應用最廣泛的是甘露蛋白和GSH[5]。

1.1 GSH的特性及結構

GSH是一種天然抗氧化物，廣泛存在于酵母、葡萄等果實中，由L-谷氨酸、L-甘氨酸和半胱氨酸組成，其半胱氨酸上連接的巰基具有獨特的氧化還原與親核特性，它能清除自由基、捕獲鄰醌[6]，防止葡萄酒氧化褐變，對葡萄酒香氣成分具有顯著的保護作用[4]。GSH在機體內具有2種存在形式：還原型GSH和GSH二硫化物(glutathione disulfide，GSSG)，其結構形式如圖1所示，2種形式可以自由轉換。酵母中谷胱甘肽循環路徑如圖2所示。GSH由谷氨酸和半胱氨酸通過2個消耗ATP過程合成，分為2個步驟。第一步，由GSH1編碼的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化谷氨酸和半胱氨酸形成二肽γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)，此步驟是限速步驟，能通過合成的終產物GSH抑制反饋[7]；第二步，谷胱甘肽合成酶(GSH2)催化二肽與甘氨酸連接。在機體發生氧化應激反應時，通過與自由基反應、谷胱甘肽過氧化物酶或谷胱甘肽S-轉移酶的催化作用，GSH被氧化為GSSG；而GSSG可通過GSH還原酶(glutathione reductase，GR)的作用，在NADPH輔助下轉化為還原型GSH[8]。

a-GSH；b-GSSG圖1 還原型GSH和GSSG分子結構Fig.1 Molecular structures of reduced GSH and GSSG

圖2 谷胱甘肽循環路徑Fig.2 Cycling pathway of glutathione

1.2 富含GSH的酵母衍生物(g-IDY)

2015年第38屆世界葡萄與葡萄酒大會暨第13屆國際葡萄與葡萄酒組織大會通過的兩項決議規定了在葡萄酒中GSH的最大使用劑量為20 mg/L，但歐洲食品添加劑法規還不允許在釀酒中直接添加GSH。富含GSH的酵母衍生物制劑可作為在釀酒和裝瓶過程中不直接添加GSH而增加還原型GSH濃度的一種天然方法[1]，但其添加標準及釋放的功能性物質含量均缺乏理論及實踐研究。

SONNI等[9]在加速氧化條件下，加入g-IDY到模型酒中，由于游離的巰基具有較強的還原性，能夠延緩模型白葡萄酒的褐變。此外，PAPADOPOULOU等[10]發現GSH在陳釀過程中對香味物質具有保護作用，尤其是揮發性成分酯、萜烯和硫醇，也能減少一些非典型的風味成分。有研究人員發現加入與g-IDY釋放的同等量的純GSH對葡萄酒香氣成分特別是揮發性硫醇的影響卻不是特別明顯，這可能是由于酵母釋放的其他物質與GSH共同作用對葡萄酒產生的積極影響。

1.3 純化甘露蛋白

甘露蛋白在果酒釀造過程中產生量和釋放量取決于酵母菌株類型和營養條件[11]。甘露蛋白占釀酒酵母細胞壁成分的35%～40%，是一種糖蛋白，甘露蛋白含有超過90%的糖，主要是甘露糖，通常高度糖基化且糖基化程度不同，位于酵母細胞壁的最外層[12]。根據甘露蛋白與細胞壁結合的形式，分為3種類型:非共價結合和與細胞壁的葡聚糖共價結合以及通過二硫鍵與其他蛋白質結合，而這些蛋白質本身又與葡聚糖共價結合[13]。作為一種有效的生物乳化劑，甘露蛋白能部分水解，在酒精發酵過程中，尤其是在酒精發酵完成后，通過β-1,3葡聚糖酶的作用釋放出來。甘露蛋白使酵母細胞壁具有活性并在很大程度上決定了細胞壁孔隙大小，從而調節蛋白質等功能物質的釋放，以及大分子物質從環境中進入細胞內。

歐盟在2005年頒布的法規(Council Regulation (EC) 2165/2005 of 20 December 2005 amending Regulation (EC) 1493/1999 on the common organization of the market in wine)中規定，可直接在釀酒中使用甘露蛋白作為釀造添加劑。甘露蛋白作為酵母釋放的最具有研究意義的多糖成分，是由于甘露蛋白能與果酒中酚類化合物作用，限制單寧的自我聚合作用，從而產生更穩定的聚合物結構[14]。

2 酵母衍生物在果酒釀造中的應用

酵母衍生物在不同果酒釀造中的應用情況舉例見表2。

2.1 作為酒精發酵促進劑

酵母作為引導酒精發酵進程的主要微生物，其所需營養物質水平決定了發酵進程速率。據研究，低水平的氮化合物可導致低發酵速率甚至發酵停滯[21]。此外，乙醇、中鏈脂肪酸等酵母菌在發酵過程中的代謝產物也可能導致這些現象，盧新軍等[22]研究得到在酒精發酵過程中添加酵母細胞壁提取物可促進酵母的生長，減輕乙醇等代謝產物對酵母的毒害作用。大多數酵母衍生物制劑主要由酵母細胞質代謝物(蛋白質、肽、氨基酸、多糖包括甘露蛋白、固醇和脂肪酸)、不溶性成分(主要是纖維素)、維生素和礦物質[4]組成，這些營養物質不僅滿足了酵母的生長代謝需要還能促進酵母中GSH前體物質的合成、合成還原型GSH，研究還發現在原料及生產工藝不變的條件下，酒體中GSH含量主要由酵母代謝所決定，環境中GSH濃度越高，酵母胞內GSH含量也越高[16]，從而促進發酵進程。酵母衍生物制劑富含的高甾醇含量也是提高酒精發酵速率的另一原因，高甾醇含量可增加酵母細胞膜的滲透性，使得細胞和培養基之間物質交換速率更高，發酵過程得以順利進行[23]。祝霞等[24]發現添加甘露聚糖可縮短酵母生長的遲滯期，能顯著提高酵母細胞活力，促進酵母菌株快速生長和繁殖，也驗證了酵母衍生物制劑作為酒精發酵促進劑的作用。

表2 酵母衍生物在果酒釀造中的具體應用情況舉例Table 2 The application of yeast derivatives in fruit winemaking industries

2.2 作為乳酸發酵促進劑

乳酸發酵不僅能降低果酒總酸度，還在提高果酒的穩定性和感官特性中起關鍵性作用[14]。但乳酸發酵進程非常緩慢，導致果酒很可能被微生物污染，出現常見的“酸敗”現象[25]。研究表明，一些酵母衍生物可以通過釋放游離氨基酸和多肽等化合物來促進乳酸菌的生長[26]，從而促進乳酸發酵進程。LONVAUD-F等[27]等發現添加0.2 g/L的酵母壁成分制劑能促進乳酸菌的生長，也有EDWARDS[28]發現酵母尸體能吸附一些對乳酸菌有害的中鏈脂肪酸，為乳酸菌提供有益的生長環境；乳酸菌還能分解酵母釋放的甘露蛋白[11]，從而為其自身生長代謝提供營養。酵母衍生物釋放的其他成分，如脂類、維生素和核苷酸，也在乳酸發酵中起到了積極作用[26]。

但值得注意的是，使用酵母衍生物為酵母補充營養提高酒精或乳酸發酵速率的同時，可能會對果酒的組成成分產生不良影響。有證據表明，補充酵母自溶物會導致酒糟中具有高濃度的生物胺，這些生物胺會影響葡萄酒的組成成分[29]。另外，使用酵母提取物也可能存在不溶性問題，對果酒的品質產生影響。這也對建立酵母衍生物制劑的使用標準、豐富酵母衍生物制劑理論和實踐數據提出了迫切需求。

2.3 保護果酒成分及提高感官特性

酵母衍生物制劑可以保護或提高果酒有益成分含量，提高感官特性也是其功能性的主要表現方面，但是其作用機理還不是很明確。比如，早期研究發現，酵母細胞壁和酵母甘露蛋白可以與果酒中的香氣化合物結合[30]，形成更穩定的化合物，防止香氣成分的損失。但從兩種不同的釀酒酵母的自溶產物中分離出來的甘露蛋白，添加到葡萄酒中，其結合能力卻表現不同[31]，這可能是由甘露蛋白純度不同導致的。

2.3.1 穩定果酒色澤

良好的色澤是果酒感官品質的重要特征之一。穩定葡萄酒色澤的前提是防止其氧化褐變。有研究表明，由酵母衍生物制劑釋放的較高濃度的還原型GSH起到了抗氧化保護作用。在酵母中，GSH約占酵母干重的1%，占低分子硫醇的95%以上，酵母細胞中高濃度GSH(10 mmol/L)及其低氧化還原電位(E0=-240 mV, pH= 7)的特點使其作為氧化還原緩沖劑參與到眾多反應中(氧化還原、抵抗外源性藥物毒性和重金屬等脅迫環境)，也在維持細胞結構完整性等基本功能方面發揮作用[32]。也有研究發現，在葡萄酒裝瓶前添加10 mg/L的GSH，可以防止葡萄酒氧化，保護葡萄酒的色澤和一些香氣化合物，減少引起異味的化合物產生[33]。但對葡萄酒產生良好效果所需要的的最佳劑量及其他釀酒參數如溫度、pH對酵母衍生物制劑釋放GSH含量的影響是未知的。另外，不同酵母菌株所制成的衍生物制劑釋放到酒中的GSH含量差別在40～80 μmol/L，3個月后在30～50 μmol/L[34]，這也為GSH的應用造成一定困難。

酵母衍生物釋放的多糖成分，也能保護果酒色澤。它們與單寧、花青素相互作用，促進色素聚合物的形成、防止聚集沉淀現象，從而使果酒顏色長時間具有更好的穩定性。已有相關研究證實在葡萄酒釀造、后浸漬及過濾階段添加酵母衍生物制劑能代替傳統的酒泥陳釀方式，增加果酒中多糖濃度及葡萄酒香氣復雜性，提高葡萄酒色澤穩定性[35]。RINALDI等[25]還發現甘露蛋白對葡萄酒顏色變化的影響差異主要取決于不同品種葡萄所導致的多酚成分差異，而非商業甘露蛋白的配方，因此，可推測對于甘露蛋白酵母衍生物制劑的使用，應主要關注果酒所用原材料種類不同所導致的成分差異。

2.3.2 降低果酒澀感

據了解，由于原花青素與口腔內的唾液蛋白相互作用，產生不溶性聚集物、沉淀，從而降低對上顎的潤滑作用，導致澀味的產生。多糖對澀感的影響機制：一方面是由于酵母衍生物釋放的多糖成分可阻止原花青素的聚集，能降低果酒的澀感(包括程度和持續時間)[36]；另一方面，多糖與多酚類物質發生競爭性結合，阻止了酚類物質與蛋白的相互作用；還有學者認為是多糖通過形成蛋白-多酚-多糖三元復合物增強了在水溶液中的溶解度，而多糖的抑制效果取決于唾液蛋白和單寧的種類[35]。另外，同時添加酵母衍生物制劑和β-葡聚糖酶，可以改善葡萄酒的顏色，釋放更多的多糖物質，從而降低葡萄酒的澀味。但也有研究表明，添加水解酶制劑(主要是聚半乳糖醛酸酶、果膠酶和其他二級活性物質如蛋白酶、半乳糖醛酸酶和纖維素/半纖維素酶)有助于顏色的形成以及增加葡萄中多糖含量，但也可能導致成酒較高的單寧含量及澀感更強烈。因此，添加水解酶制劑對果酒的影響應進一步深入研究。

2.3.3 對果酒其他感官特性的影響

酵母衍生物對果酒其他感官特性的影響主要體現在對果酒色澤、香味的修飾保護作用，去除不良物質、異味成分等。研究發現酵母細胞壁具有結合花青素的能力，主要與花青素的酰基衍生物結合，對紅酒色澤具有修飾保護作用[37]。RAZMKHAB等[38]發現酵母和酵母細胞壁能吸附白葡萄酒中的酚類物質和褐變產物，更好的維持果酒品質。還有研究學者認為酵母衍生物可以用來去除一些抑制酒精發酵的化合物，如發酵過程生成的短鏈脂肪酸。CHALIER等[31]提出當甘露蛋白質量濃度為150 mg/L時，能夠與葡萄酒中的芳香化合物結合，從而起到保留香味成分的作用，并且認為甘露蛋白分子的糖苷和肽都參與了與香味分子的相互作用，其作用效果取決于甘露蛋白的類型和酵母菌種。還有研究認為，由于酵母壁具有吸附能力，因此，可以用來去除或減少葡萄酒異味。

2.3.4 提高果酒安全性

果酒可能存在的安全隱患包括OTA污染、重金屬污染等。OTA是一種危險的真菌次生代謝產物，歐盟在2006年頒布的法規1881/2006中規定“葡萄酒中的OTA含量上限為2 μg/L”，因此，選擇合適的方式控制果酒中OTA含量成為了亟需解決的難題。隨著SCOTT等[39]1995年首次觀察到在發酵過程中，添加3種不同的釀酒酵母菌株到麥汁中，能將OTA含量減少21%以來，越來越多的研究者通過使用酵母[40]、酵母細胞壁[41]或酵母細胞壁提取物達到降低OTA的目的。MORUNO等[42]發現添加20 g/L的酵母渣(主要由酵母壁組成)在7 d后能降低葡萄酒中高達70%的OTA含量，UMMARINO等[41]也發現在白葡萄酒中由于多酚和OTA在酵母細胞表面相同的結合位點上存在競爭現象，進而顯著的降低OTA水平。已有研究表明，酵母壁中的幾丁質可以降低葡萄酒中的OTA水平[43]、甘露蛋白由于其結合能力，在去除OTA過程中也發揮了重要作用[44]，另外，OTA能自發吸附在酵母細胞壁上[45]。

葡萄酒中還可能存在其他一些有毒物質，如重金屬(鉛、鎘)等，鉛對人體內的多種酶系統產生不利影響，鎘能使含有巰基的酶失活。BORNET等[43]發現，真菌細胞壁的幾丁質能減少這兩種重金屬含量。此外，過量的鐵(>10 mg/L)會導致果酒穩定性較差，因為鐵化合物氧化后，會導致色素的沉淀。因此，為了釀造出穩定的葡萄酒，在裝瓶前，鐵的含量必須低于5 mg/L。酵母衍生物制劑的使用，可在去除這些有毒或對酒品質產生不良影響的物質方面有良好效果。

3 總結與展望

目前，不同酵母衍生物制劑在果酒釀造中取得了良好的應用成果，酵母衍生物制劑的商業化已獲得了較快的發展。其對發酵工藝的改進和酒的感官、安全性能方面的提高是其快速增長的主要原因，但其廣泛應用仍然存在一些不可忽視的問題。首先，盡管已有很多研究表明，在果酒中加入酵母衍生物會提高其感官特性，但這種效果是由酵母衍生物本身釋放的氣味化合物產生還是其對果酒本身香氣化合物的修飾改變所導致的尚不明確；第二，添加相同量的不同種類酵母衍生物，對果酒化學成分、代表性的揮發性呈香物質的作用效果都不一樣；第三，目前關于酵母衍生物的應用大多都是通過小酒窖試驗，而不是通過建立較完善的科學實驗所獲得的研究結果。這也導致大多數果酒制造商都是通過經驗來選擇酵母衍生物產品種類以及添加劑量。因此，對不同酵母衍生物制劑化學組成成分的研究變得尤為重要，建立酵母衍生物制劑統一使用標準也是今后研究工作的重點。

今后，對酵母衍生物制劑的研究還應考慮在發酵開始時添加或在浸漬過程中添加對后續步驟(如乳酸發酵)的影響，不同時段添加對果酒氧化性、穩定性等的影響。另外，在這一領域的應用研究需要創新。比如，將酵母衍生物制劑(如富含GSH非活性干酵母)與其他方法聯合使用(如物理方法：超高壓處理、高壓脈沖電場處理，化學方法：添加殼聚糖等)作為果酒中添加SO2的替代方法，研究其對果酒感官品質、貯藏性能等方面的影響，使其獲得更好的應用價值，也為減少果酒中SO2的使用提供更多的可能性。