鹽濃度對蠶豆醬發酵過程中原核微生物多樣性及理化因子的影響

楊希

(安徽糧食工程職業學院 食品生物系，安徽 合肥，230011)

蠶豆醬，也稱豆瓣醬，通常以豆瓣、谷物、面粉為主要原料，接種米曲霉制曲后與鹽水混合經天然曬制發酵而成，是我國傳統的發酵調味品[1-2]。蠶豆醬不僅具有易于消化、口感細膩、營養豐富和風味獨特等特點，還含有黃酮、花青素、多酚、礦物質及活性肽等多種生物活性物質[2-3]，具有抗氧化、抗炎、抗肥胖、預防脂肪肝、清除放射性物質等多種生理功能[4]。蠶豆醬的天然曬制過程中涉及多種微生物，這些微生物與植物基原料降解及風味形成具有重要關系。解析微生物的多樣性及其功能是篩選優良微生物菌種和實現精準人工調控的首要任務。近年來，高通量測序技術被廣泛用于探究傳統釀造食品的微生物群落組成。相關研究[5-7]開展了商業高鹽發酵蠶豆醬微生物的多樣性研究，結果表明蠶豆醬主要原核微生物包括葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、片球菌屬(Pediococcus)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)等7個屬。

食鹽作為蠶豆醬發酵的重要配料，形成高滲環境，可抑制有害微生物的生長繁殖，延長保質期，也會抑制有益微生物的生長代謝，對蠶豆醬發酵過程中的微生物群落結構演替有重要影響，從而影響蠶豆醬的抗氧化能力和品質特征[5, 8-12]。深入了解鹽濃度對蠶豆醬發酵過程中的微生物群落結構的影響機制，對生產過程中食鹽的添加量、工藝優化具有指導意義。本研究采用高通量測序技術對不同鹽濃度蠶豆醬的原核微生物多樣性進行了分析，測定了理化指標，包括理化因子變化和原核微生物群落演替。本研究不僅加深了我們對食鹽調控蠶豆醬發酵的認識，也為今后低鹽蠶豆醬的生產提供了指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：蠶豆、面粉、食鹽，本地超市；米曲霉(Aspergillusoryzae，滬釀 3.042)，沂源康源生物科技有限公司。

試劑：甲醛、氫氧化鈉、硝酸銀(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；PowerSoil?DNA提取試劑盒，美國Mobio公司；細菌16S rDNA V3～V4區擴增引物(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，廣州基迪奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PB-16 pH計，德國Sartorius公司；AB-40電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；MXX1400-30可調溫電爐，上海微行機械設備有限公司；SHP-160D生化培養箱，江蘇盛藍儀器制造有限公司；Miseq PE250 Illumina測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蠶豆醬制備

根據YANG等[10]提供的工藝制備蠶豆醬，具體方法如下：蠶豆置于清水中浸泡8～10 h，瀝干水分后于115 ℃蒸煮20 min，冷卻后，將煮熟的蠶豆與面粉以質量比1∶3混合，接種1×107CFU/g原料的米曲霉3.042孢子懸浮液。將接種后的混合物置于35 ℃和90%濕度的生化培養箱中制曲48 h，獲得成曲。將成曲分別與不同質量濃度[12 g/100mL(L)、15 g/100mL(M)、18 g/100mL(H)]的鹽水以質量比1∶1混合，置于5 L的玻璃發酵罐。用水液封后置于35 ℃培養箱恒溫發酵35 d。制備了2批不同鹽溶度的蠶豆醬樣本。為保證取樣的一致性，在發酵罐同一部位取3個樣本(30 g/樣本)，取發酵7、21、35 d的樣本，分別對應蠶豆醬的發酵前期、中期和后期[5]，-20 ℃貯藏。

1.3.2 理化因子測定

使用pH計直接測定醬醅樣本的pH值；參考GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》測定氨基酸態氮的含量；參考GB 12456—2021《食品中總酸的測定》測定總酸的含量；參考GB 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》測定食鹽的含量(以氯化鈉計)；參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定亞硝酸鹽的含量；參考GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》測定還原糖的含量(以葡萄糖計)。

1.3.3 DNA提取與Illumina Miseq高通量測序

根據PowerSoil?DNA提取試劑盒說明書的操作流程提取醬醅樣本的DNA。為降低取樣的誤差，將同一發酵時間的3個樣本的DNA進行合并。使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳及超微量分光光度計評估DNA的完整性、濃度及污染程度。將合格的DNA委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成16S rDNA擴增子V3～V4區建庫及Illumina Miseq雙端測序。

1.3.4 高通量測序數據分析

將測序數據根據條形碼進行劃分，隨后使用FLASH軟件[13]進行拼接，TRIMMOMATIC軟件[14]過濾低質量的序列，UCHIME軟件[15]去除嵌合體，得到高質量的優質序列。然后使用USEARCH軟件[16]在相似性97%的水平上進行可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類，得到OTU的代表序列。代表序列經由Silva 138數據庫[17]比對后進行物種分類注釋，比較分析蠶豆醬樣本中微生物群落結構及組成。基于注釋結果計算各蠶豆醬樣本的α-多樣性指數及各注釋水平的相對豐度。使用R軟件對原核微生物群落差異性進行的主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)、相似性分析(analysis of similarities，ANOSIM)和非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚類分析，理化因子與原核微生物群落間的相互關系進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，理化因子與主要屬水平微生物的關系進行相關性分析，不同發酵時間和不同鹽濃度的原核微生物群落分別進行線性判別分析、效應大小分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)。

2 結果與分析

2.1 不同鹽濃度發酵蠶豆醬的理化因子

總酸、氨基酸態氮、鹽度、pH、亞硝酸鹽和還原糖是蠶豆醬發酵過程中的重要理化因子。如圖1所示，3種不同鹽濃度蠶豆醬樣本的pH值在發酵7～21 d內均顯著下降(P<0.05)，且在隨后的發酵過程中保持穩定。樣本L的pH值最低，其pH值僅為4.51，而樣本H的pH值最高，為5.14。總酸含量的變化與pH值的變化呈相反的趨勢，樣本L的總酸含量最高，可達13.67 g/kg 鮮重(fresh weight，FW)，而樣本H的總酸含量最低，只有12.23 g/kg FW。蠶豆醬中總酸含量的增加會給產品帶來強烈的酸味[18]。而低鹽發酵蠶豆醬中總酸含量最高的原因可能是由于低鹽對產酸微生物(乳酸菌)的抑制作用減弱，從而導致這類微生物大量生長[9]。

氨基酸態氮含量的變化與總酸含量的變化趨勢一致，在7～21 d均顯著增加(P<0.05)，樣本L的氨基酸態氮含量從6.57 g/kg FW增加至8.77 g/kg FW，而樣本H的氨基酸態氮含量從5.21 g/kg FW增加至7.03 g/kg FW。發酵35 d，樣本L、M和H中氨基酸態氮含量分別穩定在9.17、8.17、7.41 g/kg FW，其氨基酸態氮含量符合GB/T 24399—2009《黃豆醬》的規定。氨基酸是由芽孢桿菌屬和其他微生物分泌的蛋白水解酶水解蛋白產生[5]，低鹽發酵蠶豆醬中氨基酸態氮含量最高的原因是由于較低鹽度下滲透壓低，對微生物生長繁殖及其分泌蛋白水解酶的活性抑制要小一些。

在整個發酵過程中，樣本L、M和H中食鹽含量分別穩定在4.84、6.80、8.86 g/kg FW。蠶豆醬樣本的亞硝酸鹽含量均在發酵7 d時最高，其在樣本L、M和H中的含量分別為7.86、6.35、5.16 mg/kg FW。發酵35 d，蠶豆醬樣本中亞硝酸鹽含量均低于國家衛生標準GB 2762—2017《食品中污染物限量》規定的安全水平(20 mg/kg)。此外，蠶豆醬樣本的還原糖含量在發酵7～21 d內均顯著下降(P<0.05)，且在隨后的發酵過程中保持穩定。發酵35 d，樣本L、M和H中還原糖含量分別穩定在32.64、26.83、23.27 g/kg FW。

a-pH；b-總糖；c-氨基酸態氮；d-鹽；e-亞硝酸鹽；f-還原糖圖1 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中理化因子的變化Fig.1 The changes of physicochemical factors during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations 注：大寫字母代表組件差異顯著，小寫字母代表組內差異顯著(P<0.05)

2.2 不同鹽濃度發酵蠶豆醬的原核微生物群落多樣性

18個高通量測序樣本共產生986 620條優質序列，平均每個樣本51 328～59 121條。如圖2所示，本研究所有樣本的稀釋曲線都達到平臺期，說明本次測序深度足夠覆蓋蠶豆醬樣本中絕大多數微生物種群信息。

圖2 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中原核微生物群落的 稀疏曲線Fig.2 Rarefaction curves of the prokaryotic microbial community during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

根據表1可知，3種不同鹽濃度蠶豆醬樣本的Shannon指數和Simpson指數均隨發酵時間的延長而逐漸降低。發酵35 d，樣本L具有最高的Shannon指數和Simpson指數，分別為2.31和0.47，而樣本H的Shannon指數和Simpson指數最低，分別僅為2.12和0.28，表明低鹽發酵蠶豆醬具有更豐富的物種多樣性。該結果與YANG等[10]的研究結果相一致，其發現高鹽會降低發酵豆瓣醬的物種多樣性。此外，3種不同鹽濃度蠶豆醬樣本的Pielou指數的變化與Shannon指數和Simpson指數的變化相一致。樣本H的Pielou指數最低，表明減鹽可提高蠶豆醬中原核微生物群落的物種均勻度。

表1 不同鹽濃度蠶豆醬過程中原核微生物群落序列 數量和α多樣性參數Table 1 Sequence numbers and α-diversity indices of prokaryotic microbial communities during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

PCoA用于比較各蠶豆醬樣本中原核微生物群落的差異。如圖3所示，PCoA1和PCoA2兩軸的物種累計解釋率可達77.25%。此外，我們還發現組內樣本的重復性較好，且具有時間一致性，發酵時間也會影響原核微生物群落組成。因此，我們進一步使用ANOSIM評估發酵時間和鹽濃度對蠶豆醬發酵過程中原核微生物群落的影響，揭示不同鹽濃度蠶豆醬樣本發酵過程中原核微生物群落差異原因。由表2可知，不同發酵時間的蠶豆醬原核微生物群落之間存在顯著差異(R=0.382，P=0.002)，但鹽濃度對蠶豆醬原核微生物群落差異的影響更大(R=0.554，P=0.001)，表明發酵時間和鹽濃度共同調節蠶豆醬發酵過程中原核微生物群落多樣性變化。

圖3 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中原核微生物 群落組成的主坐標分析Fig.3 PCoA of prokaryotic microbial community composition during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

表2 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中原核微生物群落 差異的相似性分析統計數據Table 2 ANOSIM statistics testing differences of prokaryotic microbial community groupings during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

2.3 不同鹽濃度發酵蠶豆醬的原核微生物群落組成

如圖4所示，經分類學注釋，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)是蠶豆醬發酵的主要優勢門(平均相對豐度≥1%)，兩者平均相對豐度分別為89.32%和7.68%，其他菌門的平均相對豐度之和僅為3%。樣本L中厚壁菌門的相對豐度隨發酵時間的延長而升高，從81.63%升高至93.31%，而樣本M和H中厚壁菌門的相對豐度則呈先增后降的變化趨勢。發酵35 d時，樣本H中放線菌門(Actinobacteria)和鹽厭氧菌門(Halanaerobiaeota)的平均相對豐度分別可達4.16%和1.64%，分別是樣本L的4.8倍和5.1倍，表明高鹽的釀造環境會促進耐鹽微生物生長繁殖。

圖4 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中原核微生物群落在 門水平的相對豐度Fig.4 The relative abundance of prokaryotic microbial communities at phylum level during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

由圖5可知，通過UPGMA聚類可將18個樣本劃分為2個簇，樣本H單獨聚為1簇(Ⅰ)，其他組樣本聚為另一簇(Ⅱ)；第Ⅱ簇又可以分為2個亞簇，樣本L和M中發酵7 d的樣本聚在第ⅰ亞簇，剩余樣本聚在第ⅱ亞簇，該結果與圖3和表2的結果相一致，說明高鹽會顯著改變蠶豆醬原核微生物的組成。在屬水平上，葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、鹽乳桿菌屬(Halolactibacillus)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、考克氏菌屬(Kocuria)、片球菌屬和四聯球菌屬是蠶豆醬發酵的主要優勢屬(至少1個樣本中相對豐度≥ 1%)。Staphylococcus、Weissella和Bacillus在所有樣本中均為絕對優勢屬，這與YANG等[10]研究結果相一致。葡萄球菌屬，如肉葡萄球菌，是豆類發酵食品的主要貢獻者之一，其主要參與酸性化合物和氨基酸的生成[19]。芽孢桿菌屬能在蠶豆醬發酵過程中分泌蛋白水解酶，有利于促進氨基酸和蠶豆醬獨特風味的形成[20]。魏斯氏菌屬具有耐鹽等特性，且可以代謝碳水化合物，為其自身生長繁殖提供能量[21]。發酵35 d，樣本H中鹽單胞菌屬、片球菌屬、鹽乳桿菌屬、考克氏菌屬和四聯球菌屬的平均相對豐度顯著高于其他2組的樣本，其平均相對豐度分別為4.14%、5.41%、4.97%、4.16%和2.97%，表明高鹽有利于這些微生物在發酵后期成為優勢屬。鹽單胞菌屬、片球菌屬和考克氏菌屬具有耐鹽的特性，能分解葡萄糖，產生多種風味物質[22]。四聯球菌屬廣泛存在于含鹽的腌制類發酵食品中，可參與氨基酸的合成及生成醛、醇、酮和酯等揮發性風味物質，從而提升發酵食品的風味和口感[23]。腸桿菌屬在發酵7 d的樣品中為優勢屬，在21 d與35 d的樣品中的豐度降低，也隨鹽濃度的升高而降低。腸桿菌屬經常可以從各種植物表面分離出來，在發酵初期的樣品中處于優勢是合理的。隨著發酵的進行，由于酸和鹽形成的環境可以抑制腸桿菌屬的生長，使其含量降低。

圖5 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中原核微生物群落在 屬水平的相對豐度及聚類分析Fig.5 Cluster analysis and the relative abundance of prokaryotic microbial communities at genus level during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

2.4 不同鹽濃度發酵蠶豆醬的標志性微生物分析

為了探究不同發酵時間和不同鹽濃度對發酵蠶豆醬中特定原核微生物種類的改變，使用LEfSe來鑒定這些特征微生物對組間差異的影響程度。由圖6可知，發酵7 d樣本顯示出更高相對豐度的變形菌門、Verrucomicrobiota和乳桿菌科(Lactobacillaceae)；發酵21 d樣本只有明串珠菌科(Leuconostocaceae)的相對豐度更高；發酵35 d樣本顯示出潛在的耐鹽微生物增加，如鹽單胞菌科(Halomonadaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、鹽厭氧菌科(Halanaerobiaceae)和芽孢桿菌科(Bacillaceae)。

為進一步明確鹽濃度對蠶豆醬原核微生物群落分類特征的影響。由圖7可知，樣本L顯示出來自乳桿菌目(Lactobacillales)的明串珠菌科具有更高的相對豐度；樣本M只有棒狀菌目(Corynebacteriales)的相對豐度更高；樣本H的標志性微生物最多，分別是葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和鹽單胞菌科。

圖6 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中不同發酵時期生物 標志性微生物的分析Fig.6 Analysis of biomarker microorganism in different stage during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

圖7 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中不同鹽濃度 生物標志性微生物的分析Fig.7 Analysis of biomarker microorganism in different salt concentrations during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

2.5 不同鹽濃度發酵蠶豆醬的理化因子與原核微生物群落的關系

冗余分析用于揭示響應變量與解釋變量之間的關系。如圖8所示，RDA1和RDA2兩排序軸解釋種群與理化因子的累計變化率分別為46.73%和14.35%，兩排序軸和為61.08%，說明冗余分析前2軸即可較好地反映出理化因子與蠶豆醬原核微生物群落的內在關聯。pH和亞硝酸鹽與發酵7 d的原核微生物群落呈正相關，而還原糖、氨基酸態氮和總酸與發酵35 d的原核微生物群落呈正相關。此外，利用條件限制分析揭示每個理化因子對蠶豆醬原核微生物群落結構的影響程度，發現鹽(21.87%)和pH(18.63%)是對群落影響最大的2個理化因子，進一步表明鹽和pH是蠶豆醬發酵過程中原核微生物演替的主要驅動力。

圖8 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中理化因子與原核 微生物菌群之間的冗余分析關系圖Fig.8 RDA between physicochemical factors and prokaryotic microbial communities during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations 注：箭頭表示理化因子與微生物群落結構之間關聯性的方向與大小: 箭頭的長度代表相關性的大小，中心點樣本菌群點之間的連線與箭頭 的夾角，銳角表示菌群與相應的理化因子呈正相關，鈍角表示負相關

基于相關性分析探究與理化因子相關的主要優勢屬微生物，由圖9可知，芽孢桿菌屬、鹽單胞菌屬、片球菌屬、嗜鹽桿菌屬(Halarcobacter)、鹽厭氧菌屬、考克氏菌屬、鹽乳桿菌屬和四聯球菌屬作為發酵35 d的優勢微生物，與鹽濃度呈顯著正相關(P<0.05)。不動桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬和魏斯氏菌屬與鹽濃度呈顯著負相關(P<0.05)。此外，葡萄球菌屬與總酸、氨基酸態氮和還原糖呈顯著正相關(P<0.05)，而芽孢桿菌屬與這些理化因子的關系與葡萄球菌屬相反。

圖9 不同鹽濃度蠶豆醬發酵過程中理化因子與屬水平 原核微生物之間的相關性圖Fig.9 Correlation analysis between physicochemical factors and prokaryotic microbial communities in genes level during the fermentation of broad bean paste with different salt concentrations

3 結論

蠶豆醬是我國主要的豆類調味品之一，其含鹽量可達9%～12%(質量分數)，但關于不同鹽濃度對蠶豆醬發酵過程中微生物群落的演替研究鮮有報道。本研究采用高通量測序和理化分析技術，揭示鹽濃度對蠶豆醬發酵過程中原核微生物群落多樣性和理化因子的影響。理化指標方面，添加12 g/100mL鹽水的蠶豆醬pH值最低，發酵后積累的總酸、氨基酸態氮和還原糖較多。鹽影響蠶豆醬發酵過程中原核微生物的多樣性和組成，但對發酵過程中葡萄球菌屬的生長沒有影響。在不同鹽濃度下，葡萄球菌屬始終是發酵過程中的優勢菌屬。添加18 g/100mL鹽水的豆瓣醬，發酵后葡萄球菌屬的相對豐度最高。芽孢桿菌屬、鹽單胞菌屬、片球菌屬、鹽厭氧菌屬、鹽乳桿菌屬、考克氏菌屬和四聯球菌屬受鹽濃度的影響顯著，且這些微生物與鹽濃度呈顯著正相關(P<0.05)。此外，冗余分析結果表明鹽和pH是蠶豆醬發酵過程中原核微生物演替的主要驅動力。這些結果有助于了解加鹽對蠶豆醬發酵生態的影響，為蠶豆醬的質量控制提供依據。