細胞凋亡調控因子BCL-2促進工程酵母合成橙花叔醇

唐學超，魏春，袁圍，孫杰

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州，310014)

萜類化合物(terpenoids)廣泛存在于微生物、真菌、高等植物以及昆蟲中，結構多樣，總數超過50 000種。橙花叔醇(nerolidol)為一種倍半萜，是香料和精油中的重要成分[1]，常見于紫丁香型、薔薇香型等各種類型的花香氣息，常作為香精香料應用于生活日化品和高檔香水中。橙花叔醇在醫學方面有一定的功效，有抑制細菌活性和體外的抗真菌作用，還具有良好的抗病毒能力[2-3]，它是維生素K1與維生素E、α-甜橙醇(柑橘清香，如甜橙醬)的重要前體[4]，同時也是治療消化性潰瘍藥物替普瑞酮的中間體[5]。

釀酒酵母的甲羥戊酸途徑的主要終端產物中，麥角甾醇占比較大，這使得釀酒酵母具備了合成多種萜類化合物的廣闊發展空間，因而被廣泛地作為合成異源萜類化合物的底盤細胞[6]。研究者通過將獼猴桃的橙花叔醇合酶基因與法尼烯合酶融合表達，轉入改造后的釀酒酵母中，橙花叔醇發酵罐產量達到1.71 g/L[7]。PENG等[8]增強釀酒酵母甲羥戊酸途徑的代謝流，使得橙花叔醇搖瓶產量達到392 mg/L，并在碳源優化后進行上罐發酵得到5.5 g/L的產量。LI等[9]克隆了來自于苦皮藤的橙花叔醇合成酶，橙花叔醇搖瓶產量740.13 mg/L，發酵罐產量達到7.01 g/L。

工程酵母菌發酵過程中因氧化脅迫、蛋白質錯誤折疊等壓力致使生產能力降低。生物產品的合成過程中，維持細胞的功能穩定性和動態穩態，對提高產物合成效率具有重要意義[10]。萜類化合物破壞釀酒酵母體內的氧化還原平衡，造成活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累，誘發氧脅迫，同時如法尼基焦磷酸等萜類代謝的中間產物對細胞均有毒性，使得細胞的魯棒性降低[11-12]。本研究在甲羥戊酸途徑增強的酵母工程菌中，表達B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)和谷胱甘肽合成酶(glutathione synthase，GSH1)，觀察它們對橙花叔醇合成的影響，并進一步在代謝水平探討BCL-2促進酵母合成橙花叔醇的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

用于進行基因克隆的DH5α大腸桿菌、合成來源于人的BCL-2(Genbank NP_000624.2)并按釀酒酵母密碼子優化，杭州擎科生物科技有限公司；釀酒酵母YS036、YS037和pRS316質粒，本實驗室保藏；GSH1(Genbank NP_012434.1)擴增于本實驗室保藏的酵母CEN.PK2-1D菌株的基因組DNA。

1.2 試劑與培養基

LB培養基(g/L)：蛋白胨10、氯化鈉10、酵母抽提物5，調節pH 7.0～7.5。

YPD培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母抽提物10。

YND培養基(g/L)：葡萄糖20、硫酸銨5、YNB 1.7。

YNS培養基(g/L)：蔗糖20、硫酸銨5、YNB 1.7。

配制上述培養基相應的固體培養基時另加20 g/L的瓊脂粉。

高純度質粒小提試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA片段回收純化試劑盒，擎科生物公司；連接試劑盒無縫克隆試劑盒，全式金公司；高保真酶，寶生物公司產品；其余試劑為國產分析純。

測定橙花叔醇的氣相色譜為GC 7890A、氣相柱為HP-5(30 m×0.25 μm,0.25 μm)，美國安捷倫；代謝組測定使用的超高壓液相色譜ExionLC和Triple TOF5600 plus質譜儀，英國SCIEX公司；液相色譜柱為ACQUITY UPLC T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),英國Waters。

1.3 實驗方法

1.3.1 過表達BCL-2和GSH1基因的菌株的構建

利用附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20210702.1642.007.html)中的pRS316-F引物和pRS316-R引物，以pRS316質粒為模板擴增表達載體的質粒骨架；使用上游引物TDH3-F和連接不同外源基因同源臂的下游引物TDH3-BCL2-R、TDH3-HSP104-R，擴增源于釀酒酵母CEN.PK2-1D基因組上的組成型啟動子TDH3；使用下游引物Leu2-R和連接不同外源基因的同源臂的上游引物Leu2-BCL2-F、Leu2-HSP104-F，以實驗室保存的YEp181質粒為模板擴增LEU2基因用作篩選標記；利用上游引物BCL2-F和下游引物BCL2-R以公司合成的BCL-2基因為模板擴增BCL-2；利用上游引物GSH1-F和下游引物GSH1-R以釀酒酵母基因組為模板對GSH1進行擴增。菌株YS037為菌株YS036轉入橙花叔醇合成酶表達質粒pYES2-A1構建而來[13]。通過overlap-PCR融合構建表達BCL-2和GSH1基因的表達盒[14]。將以pRS316為模板構建的表達載體骨架和外源基因表達盒同時轉入菌株YS037中，形成完整質粒，得到菌株YS039和YS045。

1.3.2 釀酒酵母培養條件

將構建的釀酒酵母工程菌接種至YNS液體培養基中，于搖床中30 ℃，200 r/min振蕩過夜培養得種子液。接入27 mL的YNS液體培養基中，接種量為2%，于30 ℃，200 r/min搖床中振蕩發酵培養96 h。于發酵24 h后加入3 mL十二烷用于萃取產物，發酵96 h后取發酵液離心后的有機相進行測定。

1.3.3 橙花叔醇的測定

將離心發酵液所得十二烷有機相進行氣相分析，進樣量設定為1 μL，載氣為氮氣，設置流量為1 mL/min，以1∶10分流比進行分流，60 ℃保持5 min后，以10 ℃/min的升溫速率升至280 ℃。

1.3.4 代謝組學分析

取培養96 h的菌體0.1 g，進行離心和使用液氮于坩堝中研磨。在樣品中加入50%甲醇120 μL，將其充分混勻并振蕩，進行離心20 min，轉速為4 000 r/min。上清液為所需的代謝物，將上清液置于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

樣品的液相測定條件為柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min，A和B流動相分別為水和乙腈，A和B流動相中均含有1%的甲酸。液相梯度設置為0～0.5 min：5% B；0.5～7 min：5%～100% B；7～8 min：100% B；8～8.1 min：100%～5% B；8.1～10 min：5% B。采取高分辨率的Triple TOF5 600 plus質譜儀進行樣品檢測，質譜儀參數如表1所示。將一級圖譜中信號積累太信號離子進行二級碎裂掃描。

表1 樣品檢測質譜儀參數設定Table 1 Sample detection mass spectrometer parameter setting

將得到的氣質MS數據用XCMS軟件進行選擇、分組和校準保留時間。使用KEGG、HMDB這些在線數據庫的分子質量數據與上述采集的分子質量數據(m/z)進行匹配分析，對代謝物說明注釋。有監督的偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)通過使用metaX來實現，區分組之間的不同變量，計算出每個代謝物的變量重要性投影值(variable important in projection，VIP)，篩選出>2倍差異、P<0.05、VIP>1的代謝物為顯著差異代謝物。

1.3.5 表達連接不同細胞器定位信號肽BCL-2的菌株構建

BCL-2蛋白羧基末端氨基酸序列為KTLLSLALVGACITLGAYLGHK，利用引物對mBCL2-F/mBCL2-R以構建好的BCL-2-pRS316質粒為模板，連接定位信號肽將上述羧基末端氨基酸序列替換為ILATVAATGTAI，得到將BCL-2蛋白定位于線粒體膜的表達載體[15]；利用引物對nBCL2-F/nBCL2-R以構建好的BCL-2-pRS316質粒為模板，連接定位信號肽將上述羧基末端氨基酸序列替換為PKKKRKV，得到將BCL-2蛋白定位于核膜的表達載體[16]；利用引物對ER-BCL2-1b/ER-BCL2-2和ER-BCL2-3/ER-BCL2-4b通過over lap-PCR合成內質網定位信號肽[13]，再用引物對ER-BCL2-F/ER-BCL2-R以構建好的BCL-2-pRS316質粒為模板,連接定位信號肽將上述羧基末端氨基酸序列替換為GSGTLVVILAILMLGVAYYLLNE，并用連接試劑盒與載體骨架進行連接，得到將BCL-2蛋白定位于內質網的表達載體[17]；對于截短BCL-2蛋白的表達載體，直接利用引物對tBCL2-F/tBCL2-R以構建好的BCL-2-pRS316質粒為模板擴增，得到BCL-2蛋白羧基末端氨基酸序列缺失后變為SWLSLN的BCL-2蛋白表達載體[16]。將表達載體轉入出發菌株YS036中得到對應的表達菌株。所使用引物見附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20210702.1642.007.html)。本研究涉及所有菌株見表2。

表2 本研究涉及到的菌株Table 2 Saccharomyces cerevisiae strains used in this reserch

2 結果與分析

2.1 BCL-2和GSH1表達對酵母工程菌合成橙花叔醇的影響

BCL-2是一種來自于哺乳動物細胞內的抗凋亡蛋白，釀酒酵母中并不存在BCL-2的同源序列，但其在釀酒酵母中表達后具有一定生理活性，例如，通過減少ROS的生成抑制細胞凋亡，使得釀酒酵母超氧化物歧化酶缺失菌株的生存效率提高[18]。GSH1是編碼最常見的非酶系抗氧化物谷胱甘肽的2種同工酶之一，通過控制自由基的生成，在保護細胞膜和維持氧化還原穩態方面發揮重要作用[19]。在上述研究中，BCL-2和GSH1等基因在酵母體內高表達使得釀酒酵母緩解環境和異源表達產生的氧化壓力，因此我們推測這2種蛋白的表達可能促進工程酵母橙花叔醇的合成。

將構建好的工程菌接種于YNS培養基中搖瓶發酵96 h，對發酵液處理后測定橙花叔醇的產量，如圖1所示。在發酵96 h后，相對于菌株YS037(336.5 mg/L)而言，菌株YS039和YS045的產量分別提高了77.7%和32.7%，達到594.1、446.9 mg/L。因此，過表達BCL-2和GSH1的菌株橙花叔醇的合成起到了促進作用。在大部分哺乳動物的細胞體內，在連續不斷的內質網壓力下，未折疊蛋白應激反應(unfolded protein response，UPR)通過促凋亡蛋白的轉錄和翻譯后調控，引發細胞凋亡。來源于人的細胞凋亡調控因子BCL-2與細胞凋亡、UPR、細胞自噬和Ca2+平衡的信號途徑均有聯系，是壓力信號網絡的關鍵調節劑，其與癌癥的發生也有密切關系[20-21]。BCL-2蛋白家族可以細分為2大類，一類為促凋亡亞家族，另一類為抗凋亡亞家族。其中，促凋亡蛋白Bax通過直接激活UPR，使得HAC1的mRNA被剪切；同時GCN4、DER1和KAR2等UPR的靶基因也可以被Bax蛋白誘導表達[22]。而第二類抗凋亡蛋白BCL-2與BCL-XL能夠與第一類促凋亡蛋白Bax進行結合，來減弱Bax在促凋亡中的活性，同時改變內質網的壓力，但其調節機理仍未明確[22-23]。在釀酒酵母中，有2種平衡胞內氧化還原的系統，分別為含抗氧化酶的系統和非酶的保護系統。增強編碼谷胱甘肽的同工酶GSH1的表達強度，使得還原型谷胱甘肽通過氧化作用生成氧化型谷胱甘肽并控制自由基的生成，保護細胞膜和維持氧化還原穩態，從而在一定程度上減弱ROS的積累，提高菌株活力。因為BCL-2對酵母合成橙花叔醇的促進作用比GSH1更強，因此后面的研究以表達BCL-2的工程酵母菌株作為研究對象。

圖1 BCL-2和GSH1表達對酵母工程菌合成 橙花叔醇的影響Fig.1 Effects of BCL-2 and GSH1 expression on nerolidol production in engineered yeast 注：以YS037菌株產量為對照進行分析，誤差線表示3次平行 測定的標準差，*表示P<0.05，**表示P<0.01(下同)

2.2 表達BCL-2蛋白和不表達BCL-2蛋白工程菌的代謝組學研究

YS037和YS039發酵96 h的細胞進行代謝物提取和液相色譜質譜聯用儀測定后，進行主成分分析(principal components analysis，PCA)，各個樣品依據重新組合后的變量都可以進行正確的分組，2種工程菌株導致的63.5%的樣品數據差異見圖2-a。為了對差異代謝物進行確定，使用PLS-DA模型對樣品進一步進行分類(圖2-b)，建立其PLS-DA模型。對于表達BCL-2蛋白(YS039)和不表達BCL-2蛋白(YS037)的樣品組的PLS-DA模型，R2=0.999，Q2= 0.991，說明PLS-DA模型構建成功。滿足VIP>1且P<0.05的代謝物定義為差異代謝物。基于PLS-DA的結果，工程菌株YS037和YS039的差異代謝物一共有182種。

差異代謝物途徑富集分析如圖3所示，表明BCL-2蛋白的表達主要影響了半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、色氨酸等氨基酸的代謝途徑、α-亞麻酸和亞油酸等脂肪酸代謝途徑以及泛酸和輔酶A的生物合成途徑等。與未表達BCL-2蛋白的菌株相比，富集于氨基酸代謝途徑的差異代謝物主要為下調的代謝物。下調氨基酸的代謝是否可以促進酵母工程菌中萜類化合物的合成仍未被完全證實。我們推測，胞內氨基酸含量的下調可能是由于前體羧酸的轉化受到抑制，而調節羧酸轉化也許是提高萜烯生物合成的一個策略。富集于谷胱甘肽、α-亞麻酸和亞油酸的代謝途徑以及泛酸和輔酶A的生物合成途徑的差異代謝物多為上調的代謝物。谷胱甘肽作為一種非酶系抗氧化物，其代謝的上調可以起到抗氧化的作用對細胞進行保護。而不飽和長鏈脂肪酸中的亞麻酸和亞油酸則對釀酒酵母的生長繁殖和抗逆性的提高有顯著促進作用。泛酸和輔酶A的合成的上調則可以提高甲羥戊酸途徑前體乙酰輔酶A的合成，并進一步增加釀酒酵母合成萜烯的能力。對于差異代謝物途徑富集的分析在代謝水平基本解釋了BCL-2蛋白對釀酒酵母產萜類能力的促進作用的機制，為進一步提高萜類在工程酵母菌中的產量提供了理論依據。

a-所有樣品的PCA;b-所有樣品的PLS-DA圖2 菌株YS037和YS039的代謝物組成差異分析Fig.2 Differential analysis of metabolite composition of strains YS037 and YS039

2.3 連接不同定位信號肽的BCL-2蛋白對內源性橙花叔醇合成的影響

哺乳動物BCL-2一般分布于細胞的線粒體、內質網和核膜中，在細胞質中含量較低[16]。釀酒酵母自身可以合成少量的法尼醇和橙花叔醇[24]。為進一步探究BCL-2蛋白定位于不同細胞器表達時，對橙花叔醇產量的影響，將線粒體內膜、內質網和核膜的定位信號肽連接BCL-2蛋白，觀察其對內源性萜類化合物產量的影響。我們發現當搖瓶培養不控制pH時，酵母可以合成的內源性萜類以橙花叔醇為主。以未連接定位信號肽的BCL-2蛋白的菌株(TXC25)相比，BCL-2連接內質網定位信號肽(TXC21)、線粒體內膜定位信號肽(TXC22)、核定位信號肽(TXC23)和羧基端截短的BCL-2蛋白(TXC24)，內源性的橙花叔醇產量分別提高了30%、2.8%、2%和5.2%(圖4)。

圖3 YS039與YS037差異代謝物代謝途徑富集Fig.3 Pathway enrichment of differential metabolites by YS037 versus YS039

圖4 BCL-2蛋白連接不同細胞器定位信號肽對 酵母內源性橙花叔醇合成的影響Fig.4 Effects of different organelle localization signal peptides linked to Bcl-2 protein on endogenous nerolidol synthesis in yeast 注：以TXC25菌株產量為對照進行分析

之后在菌株TXC21中轉入帶有橙花叔醇合成酶基因的質粒pYES2-A1，對比菌株YS039橙花叔醇產量提高了29.2%，達到767.6 mg/L。這可能與BCL-2 蛋白抑制細胞自噬的作用機制有關，目前已經發現BCL-2蛋白降低內質網的Ca2+穩態水平，進而誘導一系列調控機制來抑制細胞自噬，提高細胞活力[25]。然而本研究中定位信號肽是否將BCL-2蛋白定位至目標細胞器，還有待進一步確認。本研究為提高釀酒酵母工程菌產萜類化合物提供了新的策略。

3 結論

本研究觀察到BCL-2和GSH1基因的表達對工程釀酒酵母產橙花叔醇有促進效果，并進一步通過代謝組分析對BCL-2蛋白的作用機制進行了探究，發現BCL-2蛋白的表達影響菌株氨基酸和脂肪酸的代謝，并與泛酸和輔酶A的生物合成途徑有關。另外，對連接不同定位信號肽的BCL-2蛋白對工程菌橙花叔醇合成的影響進行了探究，發現當BCL-2蛋白與內質網膜定位肽連接時對橙花叔醇產量的促進作用最大，為解釋其作用機制提供了有力支持。本研究對提高釀酒酵母工程菌異源生產萜類化合物提供了一個新的策略。