羥自由基氧化對花生球蛋白結構和功能性質的影響

尹可宏，楊茜，趙秀飛，楊曦，李云嵌，張雪春*

1(西南林業大學 生命科學學院，云南 昆明，650224)2(尋甸回族彝族自治縣衛生健康綜合監督執法局，云南 昆明，655200)

花生(ArachishypogaeaL.)隸屬于豆科一年生草本植物，是我國種植產量最豐富、食用最廣泛的堅果之一，其作為世界四大油料作物之一，富含蛋白質、脂肪和碳水化合物，具有很高的營養價值[1]。花生仁中含有24%～36%的蛋白質，大部分為鹽溶性蛋白[2]。其中，花生球蛋白約占總蛋白的63%，分子質量為350 kDa[3]，其具有較好的乳化性、起泡性、吸水性和凝膠性等功能特性，可作為一種優良的食品原料廣泛應用于食品領域。

研究發現，食品體系中的蛋白質易受到自由基作用發生氧化，導致食品中蛋白質營養損失、風味惡化以及功能性質下降，進而影響食品品質。如不飽和脂肪酸氧化酸敗可使核桃蛋白發生氧化，使其食品色澤、風味及品質發生改變，營養價值降低[4]；崔旭海等[5]發現氧化可導致乳蛋白物理、化學性質發生改變，進而改變其凝膠能力、保水能力和乳化能力；李艷青等[6]發現不受控制的激烈氧化環境會導致大豆蛋白功能性質下降。但這些研究主要是針對核桃、大豆、米等植物蛋白進行研究，對于花生蛋白組分的功能性質評估相對較少，而關于羥自由基氧化對花生球蛋白結構、功能性質的影響方面的研究鮮有報道。因此，本研究選取花生球蛋白為研究對象，利用鐵/過氧化氫/抗壞血酸(Fe/H2O2/Asc)建立羥自由基氧化體系(hydroxyl radical oxidation system，HROS)，對花生球蛋白進行不同程度的氧化處理，考察羥自由基氧化對其結構和功能性質的影響，從而為花生的進一步開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

花生仁(云南紅殼小花生)購于昆明；牛血清白蛋白、福林酚試劑，上海源葉生物科技有限公司；過氧化氫、三氯乙酸、乙酸乙酯、三氯化鐵、抗壞血酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，天津市風船化學試劑科技有限公司；三羥基甲基氨基甲烷-甘氨酸(trihydroxymethylaminomethane-glycine，Tris-Gly)緩沖溶液、2，4-二硝基苯肼(2, 4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid，ANS)，天津市致遠化學試劑有限公司。以上藥品、試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

5804R型多功能臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；艾卡IKA RV10基本型立式旋轉蒸發儀，南京榮華科學器材有限公司；Infinite F50型酶標儀，瑞士Tecan公司；F-7000型日立熒光分光光度儀，日本日立公司；Jasco J-715圓二色譜儀，佰泰科技有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生球蛋白的提取

花生仁經粉碎后置于燒杯中，加入5倍體積的石油醚，室溫條件下進行攪拌脫脂3 h(重復3次)，風干后過40目篩，即為脫脂花生粉。按照料液比1∶15(g∶mL)向脫脂花生粉中加入0.05 mol/L pH 7.9的Tris-HCl緩沖液，于30 ℃的環境下攪拌提取1 h，然后在4 ℃的環境中，以4 000 r/min離心30 min，保留上清液。在上清液中加入NaHSO3，使得上清液含NaHSO3濃度為0.01 mol/L，調節pH至6.4，同樣于30 ℃的環境下攪拌提取1 h。再次離心，沉淀用去離子水洗3次，凍干后即為花生球蛋白。

1.2.2 羥自由基氧化花生球蛋白的制備

參照PARK等[7]的方法并略加修改，通過鐵/過氧化氫/抗壞血酸(Fe/H2O2/Asc)體系產生羥自由基，主要是由FeCl3和H2O2通過氧化還原反應而產生。在氧化體系中分別加入花生球蛋白，使其最終質量濃度為10 mg/mL，添加H2O2使其終濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10、15 mmol/L，同時固定FeCl3和抗壞血酸在體系中終濃度為0.1 mmol/L，并置于搖床中37 ℃恒溫孵育氧化24 h后，添加EDTA終止氧化反應，然后于去離子水中透析72 h，凍干后即為氧化花生球蛋白。以花生球蛋白添加等體積0.01 mmol/L pH 7.9的Tris-HCl緩沖液代替Fe/H2O2/Asc體系作為對照組。

1.2.3 羰基含量的測定

參照HUANG等[8]的方法并略加改動。用0.01 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl、pH 7.9)將氧化后的花生球蛋白粉配制成質量濃度為10 mg/mL的蛋白液。取4.5 mL 10 mg/mL的蛋白液于50 mL離心管中，加入3 mL 10 mmol/L的DNPH溶液，混勻后于室溫避光靜置1 h，并每隔10 min振蕩1次，然后加入3 mL 200 mg/mL的三氯乙酸溶液終止反應。在8 000 r/min下離心15 min，保留沉淀物，用3 mL等體積比的乙酸乙酯-乙醇溶液進行洗滌3次(去除未反應試劑)。加入12 mL 6 mol/L的尿素溶液，在37 ℃水浴下溶解沉淀20 min，最后在10 000 r/min下離心15 min，取1 mL上清液于370 nm處測定吸光值。以3 mL 2 mol/L的HCl溶液代替DNPH溶液作為空白對照。

1.2.4 游離巰基與總巰基含量的測定

參照HUANG等[8]的方法并略加修改。取45 mg花生球蛋白分散在15 mL測試液中，于25 ℃保溫1 h后，在25 ℃ 10 000 r/min離心15 min。取5 mL上清液，并添加50 μL 4 mg/mL的DTNB溶液，混勻靜置15 min后取1 mL上清液于412 nm處測吸光值。以5 mL的Tris-Gly緩沖液、5 mL含8 mol/L尿素的Tris-Gly緩沖液代替上清液分別作為測量游離巰基和總巰基含量的試劑空白。其中，Tris-Gly緩沖液(pH 8.0)用作游離巰基含量的測試液，pH 8.0含8 mol/L尿素的Tris-Gly緩沖液用作總巰基含量的測試液。

1.2.5 紫外掃描光譜測定

參照BACHRI等[9]的方法并略加修改。以pH 7.90.01 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液為空白，在室溫下測定質量濃度為1 mg/mL氧化后花生球蛋白的紫外吸收圖譜。

1.2.6 差示熱量掃描儀(differential scanning calorimetry，DSC)測定

參照PUGLIESE等[10]的方法并略加修改。采用DSC分析樣品的熱力學性質，稱取5～10 mg樣品至鋁坩堝中，然后密封壓片，置于差示掃描熱分析儀分析。設置初始溫度為20 ℃，然后以10 ℃/min的速率升溫至120 ℃。

1.2.7 圓二色譜測定

參照LEE等[11]的方法并略加修改。將未氧化和氧化的花生球蛋白分別用去離子水配制成質量濃度為50 μg/mL的蛋白溶液，之后用圓二色譜儀在25 ℃下測定其在190～250 nm的遠紫外圖譜。以去離子水作為空白對照。在掃描速率、間隔時間、寬度以及最小間隔度分別為100 nm/min、0.25 s、1.0 nm和0.2 nm條件下進行測定。通過線性擬合出花生球蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構的含量。

1.2.8 花生球蛋白溶解度的測定

參照WANG等[12]的方法并略加修改。花生球蛋白以50 mmol/L pH 7的磷酸鹽緩沖液配制成1 mg/mL溶液，攪拌1 h后，于8 000 r/min離心15 min，用福林酚法測定上清液中蛋白質含量，并用凱氏定氮法測定樣品中總蛋白質含量。按公式(1)計算花生球蛋白的溶解性:

(1)

1.2.9 花生球蛋白濁度的測定

參考JIANG等[13]的方法并略加修改。吸取5 mL 1 mg/mL經不同羥自由基氧化體系氧化的花生球蛋白溶液于試管中，在40 ℃的水浴鍋中水浴30 min后取出，冷卻后在600 nm處測定吸光值，用吸光度代表濁度。以不加花生球蛋白的溶液為空白。

1.2.10 花生球蛋白起泡性及起泡穩定性的測定

參照CANO-MEDINA等[14]的方法并略為修改。花生球蛋白以50 mmol/L pH 7的磷酸鈉緩沖液配制成質量濃度為1 mg/mL的溶液，攪拌1 h后取40 mL蛋白液于10 000 r/min均質分散2 min，分別測定 0 min 和60 min的蛋白液的總體積。花生球蛋白的起泡性與起泡穩定性分別按公式(2)和公式(3)計算:

(2)

(3)

式中：V，初始體積，mL；V1，分散后0 min的體積，mL；V2，靜置60 min的體積，mL。

1.2.11 花生球蛋白乳化性及乳化穩定性的測定

(4)

(5)

式中：A0，0 min的吸光值；A10，靜置10 min的吸光值；N，稀釋因子，500；ρ，蛋白質量濃度，g/mL；φ，乳狀液油相體積分數，25%；L，比色光徑，1 cm；t，時間間隔，10 min。

1.2.12 花生球蛋白表面疏水性的測定

1.2.13 數據處理與分析

所有實驗均重復3次以上，實驗數據以平均值±標準偏差表示。采用Origin 8.6軟件分析和作圖，SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，P<0.05認為樣品間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 羥自由基氧化對花生球蛋白羰基含量的影響

蛋白質中側鏈上帶有—NH或—NH2的氨基酸容易受羥自由基氧化而產生羰基，羰基含量可以反映出蛋白質氧化程度[16]。HROS對花生球蛋白羰基含量的影響如圖1所示。隨著H2O2濃度的增加，羰基含量整體以濃度依賴性呈現明顯上升趨勢。當H2O2濃度為0～5 mmol/L時，其羰基含量緩慢上升；當H2O2濃度為10 mmol/L時，其羰基含量迅速增加，并在H2O2濃度為15 mmol/L時含量達到最高值，為(29.69±0.14) nmol/mg，是對照組[(16.05±0.13) nmol/mg]的1.85倍(P<0.05)。該結果表明花生球蛋白的氧化程度隨H2O2濃度的增加而逐漸增強，這與ZHANG等[17]研究結果相一致。可能是因為隨著H2O2濃度的增加，越來越多的羥自由基會進攻氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基，使部分氨基酸殘基和多肽鏈發生氧化，進而氧化生成羰基衍生物和NH3，故隨著氧化劑用量的增大，氧化體系產生的羰基含量也逐漸增加。

圖1 羥自由基氧化后花生球蛋白羰基含量變化情況Fig.1 Changes of carbonyl content of arachin after hydroxyl radical oxidation 注：不同字母表示同組間不同氧化程度的花生球蛋白樣品之間 差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 羥自由基氧化對花生球蛋白游離巰基和總巰基含量的影響

蛋白被氧化之后，其總巰基和游離巰基含量會發生下降，可用于表征氧化程度。HROS對花生球蛋白的游離巰基和總巰基含量的影響如圖2所示，在一定范圍內隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白游離巰基和總巰基含量均逐漸減少。當H2O2的濃度為15 mmol/L時，游離巰基和總巰基含量分別減少至(9.49±0.12)、(10.00±0.21) μmol/g，分別是對照組[(14.35±0.41)、(15.88±0.35) μmol/g]的66%和0.63%(P<0.05)，表明花生球蛋白的氧化程度逐漸增強，這與本課題組前期的結果相一致[2]。這可能是在H2O2的作用下，花生球蛋白中的巰基被氧化生成二硫鍵或進一步氧化生成磺酸類等產物，從而導致蛋白質表面的游離巰基和總巰基含量下降。

圖2 羥自由基氧化后花生球蛋白游離巰基和總巰基含量 變化情況Fig.2 Changes of free sulfhydryl groups and total sulfhydryl groups in arachin after hydroxyl radical oxidation 注：游離巰基含量用不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)， 總巰基含量用不同大寫字母表明顯著性差異(P<0.05)

2.3 羥自由基氧化對花生球蛋白紫外掃描光譜的影響

蛋白質中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等氨基酸能吸收一定的波長范圍的紫外光，因此蛋白質的紫外光譜能直觀地反映出其結構的變化情況[18]。HROS對可溶性花生球蛋白紫外掃描光譜的影響如圖3所示，未氧化的花生球蛋白最大吸收峰在287 nm處，隨著H2O2濃度的增加，吸收峰強度明顯減弱，當H2O2的濃度達到15 mmol/L時，峰強度最低，說明上清液中花生球蛋白的含量隨氧化程度加深而逐漸降低。花生球蛋白的λmax發生輕微藍移，表明分子表面可吸收紫外光的殘基減少，即花生球蛋白中部分可吸收紫外光的氨基酸基團因氧化程度增大而引起結構變化[19]。在280～287 nm處，氧化處理后花生蛋白的吸收峰強度出現了明顯的上升，這可能是因為氧化引起了蛋白質聚集，導致蛋白質的構象發生了變化，從而使其紫外吸收光譜發生了改變[20]。

圖3 羥自由基氧化后花生球蛋白的紫外掃描圖譜Fig.3 Ultraviolet scanning atlases of arachin oxidized by hydroxyl radical

2.4 羥自由基氧化對花生球蛋白DSC曲線的影響

當物質所處的溫度環境發生變化時，會導致物質能量也隨之發生改變，其表現方式為吸熱或放熱，因此可通過觀測蛋白質的熱能差異來反映蛋白質結構的變化[21]。HROS修飾后的花生球蛋白的DSC掃描曲線如圖4所示，在不同H2O2濃度下花生球蛋白的放熱幅度有所差異，但其變化曲線規律基本一致。隨著H2O2濃度的提高，花生球蛋白放熱峰的溫度依次為74、72、70、75、70、72、73 ℃，與對照組(72 ℃)相比無明顯變化，表明羥自由基氧化對花生球蛋白的熱穩定性影響較小，這和YAMAGUCHI等[22]報道的結果相一致。

圖4 羥自由基氧化后花生球蛋白的DSC曲線Fig.4 DSC curve of arachin after hydroxyl radical oxidation

2.5 羥自由基氧化對花生球蛋白圓二色譜的影響

在蛋白質分子中，肽鏈的不同部分可分別形成α-螺旋、β-折疊、β-轉角等特定的立體結構，這些立體結構都是不對稱的，且蛋白質的肽鍵在紫外185～240 nm處有光吸收，使其在這一波長范圍內有圓二色性[23]。因此，利用圓二色譜可以靈敏地檢測出蛋白質二級結構(α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲)的變化，其結果如表1所示。隨著H2O2濃度的增加，可溶性花生球蛋白二級結構中的α-螺旋結構明顯減少，無規則卷曲結構明顯增加(P<0.05)，而β-折疊、β-轉角變化不明顯(P>0.05)。結果表明經羥自由基氧化處理后，可溶性花生球蛋白的二級結構中α-螺旋減少、無規則卷曲增加，其他結構變化不明顯，這與DEL等[24]的研究結果相類似。同未氧化的花生球蛋白相比，當H2O2濃度為15 mmol/L時，花生球蛋白α-螺旋減少6.25%、無規則卷曲增加10.25%，這也同樣說明在H2O2氧化的過程中，可溶性花生球蛋白的二級結構會發生一定改變，其變化規律則與氧化的條件和程度有關。

表1 羥自由基氧化后花生球蛋白二級結構變化情況Table 1 Changes of secondary structure of arachin after hydroxyl radical oxidation

2.6 羥自由基氧化對花生球蛋白溶解度的影響

蛋白溶解度是蛋白質之間、蛋白質與溶劑之間相互作用的結果，與其粒徑大小有一定的關系，可用于表征蛋白質交聯及聚集的程度，同時也是蛋白質具有其他功能性質的必要條件[25]。HROS對花生球蛋白溶解度的影響如圖5所示，隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白溶解度呈下降趨勢，當H2O2濃度為15 mmol/L時其溶解度減小至(50.98±0.14)%，顯著低于對照組的(68.50±0.36)%(P<0.05)。這可能是由于羥自由基破壞了花生球蛋白的構象，并隨著羥自由基濃度的增大，花生球蛋白疏水基團逐漸暴露，蛋白質發生共價交聯，使可溶性聚集體進一步聚集形成不可溶性聚集體，導致蛋白質水化作用逐漸減弱，溶解度下降，這與WANG等[12]結果相一致。

圖5 羥自由基氧化對花生球蛋白溶解度的影響Fig.5 Effect of hydroxyl radical oxidation on the solubility of arachin

2.7 羥自由基氧化對花生球蛋白濁度的影響

濁度是指當光線通過溶液時所產生的阻礙程度，可以反映出其溶解度的大小。本實驗采用樣品在600 nm下的吸光值表示其濁度，結果如圖6所示。經氧化后花生球蛋白的濁度均高于對照組，且隨著H2O2濃度的增大而遞增(P<0.05)。當H2O2濃度為15 mmol/L時，花生球蛋白的吸光度達到0.20±0.001，其濁度是對照組(0.07±0.001)的2.86倍。該結果與JIANG等[13]結果相一致，原因是氧化使蛋白質分子之間發生交聯反應而聚集，導致其溶解度下降，濁度上升。本論文中，濁度的實驗結果與溶解度的現象相一致，進一步說明氧化會使蛋白質分子發生聚集，從而導致其溶解度降低。

圖6 羥自由基氧化對花生球蛋白濁度的影響Fig.6 Effect of hydroxyl radical oxidation on the turbidity of arachin

2.8 羥自由基氧化對花生球蛋白起泡性和起泡穩定性的影響

蛋白質的起泡性可以賦予食品疏松的結構，使其具有良好的口感，其與蛋白中可溶性蛋白含量及其在溶液中的穩定性相關[26]。HROS對花生球蛋白的起泡性和起泡穩定性的影響如圖7所示，隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白起泡性呈先增加后下降的趨勢，起泡穩定性呈逐漸上升的趨勢。原因是經過羥自由基氧化后，蛋白分子部分展開，其內部疏水殘基暴露在蛋白表面，使蛋白質分子能迅速吸附至氣-水界面，進而增強起泡性；隨著氧化程度的加深，巰基逐漸氧化形成二硫鍵而發生更大交聯，形成蛋白聚合物等不可溶的聚集體，使界面張力增加。同時溶解度的降低使其用來發泡的有效蛋白質含量降低，故而起泡性減小[27]。起泡穩定性隨H2O2濃度增加而逐漸上升，且當H2O2濃度為15 mmol/L時(P<0.05)，起泡穩定性最好[(27.44±0.11)%]，這可能是部分暴露的疏水性基團發生相互吸引，使得泡沫穩定性增強[14]。

圖7 羥自由基氧化對花生球蛋白起泡性和起泡穩定性 的影響Fig.7 Effects of hydroxyl radical oxidation on the foaming and foaming stability of arachin 注：起泡性用不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)， 起泡穩定性用不同大寫字母表明顯著性差異(P<0.05)

2.9 羥自由基氧化對花生球蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

乳化性質是指蛋白質與食品體系中的油和水形成乳狀液的能力，其是蛋白質的一項重要的功能性質，一般通過乳化性和乳化穩定性來評價蛋白質的乳化能力[28]。HROS對花生球蛋白的乳化性和乳化穩定性的影響如圖8所示，隨H2O2濃度增大，花生球蛋白乳化性及乳化穩定性均呈先增加后下降的趨勢。當H2O2濃度為1 mmol/L時，乳化性最高為(79.2±0.62) m2/g；當H2O2濃度為0.5 mmol/L時，乳化穩定性最好為38 min(P<0.05)。這是因為蛋白質的乳化性能受其溶解度、粒徑、分子柔韌性等影響，當低濃度的H2O2作用于花生球蛋白時，維持花生球蛋白空間結構的非共價鍵(疏水相互作用、靜電相互作用)被破壞，蛋白分子內部疏水基團暴露，分子柔韌性提高，更多的蛋白分子結合到油-水界面，使花生球蛋白的乳化性和乳化穩定性增加[29]。繼續增大H2O2濃度，巰基逐漸被氧化形成二硫鍵，蛋白質發生交聯形成不可溶性聚集體，使其溶解度下降、分子柔韌性降低、蛋白表面積縮小，導致花生球蛋白的乳化性及乳化穩定性下降。

圖8 羥自由基氧化對花生球蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Fig.8 Effects of hydroxyl radical oxidation on the emulsification and emulsification stability of arachin 注：乳化性用不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)， 乳化穩定性用不同大寫字母表明顯著性差異(P<0.05)

2.10 羥自由基氧化對花生球蛋白表面疏水性的影響

蛋白質的表面疏水性是維持蛋白質三級結構的主要作用力，可用于蛋白表面疏水性來衡量蛋白質的變性程度，對蛋白質結構和功能性質的穩定具有重要意義。HROS對可溶性花生球蛋白表面疏水性的影響如圖9所示，隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白的表面疏水性逐漸下降，且當H2O2濃度為15 mmol/L時，疏水性最低為10±1，與對照組(112±3)相比減少了102(P<0.05)，這與RAMREZ等[15]的研究結果相似。在蛋白質氧化過程中，HROS誘導蛋白質內部氨基酸殘基發生氧化，使蛋白質去折疊而外露出疏水基團，進而通過疏水作用形成聚集體，隨著H2O2濃度的增大，其表面疏水性逐漸減小，這可能是由于花生球蛋白形成聚集體所致[30]。

圖9 羥自由基氧化對花生球蛋白表面疏水性的影響Fig.9 The effect of hydroxyl radical oxidation on surface hydrophobicity of arachin

3 結論

本研究以羥自由基氧化體系建立氧化模型，對花生球蛋白進行不同程度的氧化處理，并考察羥自由基氧化體系對花生球蛋白結構及功能性質變化的影響。結果表明，羥自由基氧化對花生球蛋白結構和功能性質都會產生一定的影響，在一定范圍內隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白的羰基含量、濁度、起泡穩定性呈上升的趨勢；游離巰基、總巰基、溶解度、紫外吸收峰強度和表面疏水性呈現降低的趨勢；乳化性、乳化穩定性和起泡性呈先上升后下降的趨勢；而HROS對可溶性花生球蛋白二級結構中α-螺旋、無規則卷曲也造成一定的影響。結果說明氧化使花生球蛋白的結構及功能性質發生了一定的變化。因此，可在貯藏加工過程中采取有效措施來控制花生的氧化程度，減少過度氧化引起的花生品質的劣變，也可以通過適度氧化以改善其加工性質。本研究可以為花生資源的進一步開發和利用提供一定科學依據。