膽堿測定電極的膽堿氧化酶固定化研究

宋旸，王偉寧，姚靜，王睿瑩，羅淑年，王立琦,*

1(哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱，150028)2(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 3(哈爾濱商業大學 計算機與信息工程學院,黑龍江省電子商務與信息處理重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150028)

膽堿是卵磷脂的主要成分，也是神經遞質乙酰膽堿生物合成的前體[1]。膽堿對人體具有極其重要的作用，它能夠促進脂肪的分解，傳遞神經信號。膽堿的缺乏會影響記憶力，并且容易導致肝功能障礙，甚至引發癌癥。此外，阿爾茨海默病和帕金森病等神經退行性疾病也與膽堿的異常代謝有關[2]。雖然人體可以合成膽堿，但是飲食中也需要膽堿的攝入[3]。一些國家的兒科學會、食品和營養委員會為嬰兒以及成人制定關于膽堿每日攝入量的標準[4]，因此食品中膽堿含量的檢測具有重要的意義。檢測食品中的膽堿含量通常采用氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、離子色譜[7]、色譜-質譜聯用法[8]、熒光檢測法[9]、比色法[10]等傳統檢測方法，但這些檢測方法普遍成本高、操作復雜、分析速度慢、難以快速實時檢測，因此研究新型便攜的食品中膽堿檢測技術是極其必要的。

利用光電化學分析原理，研制敏感化的光敏電極，能夠實現食品中膽堿的快速實時檢測。膽堿氧化酶(choline oxidase，ChOx)是光電化學檢測膽堿的關鍵用酶，可以催化膽堿生成電子供體H2O2，在光激發下，電極上的光活性物質會得到H2O2的電子，組成光致電化學循環系統，利用光電化學手段，探究光電化學信號對膽堿的響應。由于游離態的酶分析精度、穩定性和循環利用性較差[11]，所以ChOx作為生物敏感元件固定于光敏電極可有效提高其檢測的效率。固定化的酶需要保持其結構、功能和生物活性，在光敏酶電極使用的過程中不易發生解吸，理想的酶電極同時具有重現性和貯藏穩定性，酶的固定化方法直接影響著光敏酶電極的精度和穩定性[12]，因此要選擇合適的光敏電極上酶的固定化方法。

用于電極上酶的固定化方法主要有吸附法[13]、包埋法[14]、共價結合法[15]、交聯法[16]以及親和法[17]等。ZHANG等[18]將乙酰輔酶A和輔酶A吸附固定于金電極上，基于陰極溶出伏安法進行肉堿的靈敏測定。LIU等[19]利用Nafion將酪氨酸酶與堿性磷酸酶固定在生物炭納米顆粒修飾的玻碳電極上，用于雙酚A的檢測，具有較好的重現性和穩定性。RAHMAN等[20]采用共價結合法將ChOx固定于修飾電極上，用于膽堿的快速檢測。但是由于共價結合法的反應條件比較強烈，會引起酶蛋白高級結構的改變，降低了固定ChOx的比活力，因此需探究更適宜的光敏電極上ChOx固定化方法用于膽堿的快速檢測。

本文基于二氧化錫納米粒子(SnO2nanoparticles，SnO2NPs)和聚硫堇(polythioine，PTh)修飾的氧化銦錫(indium tin oxide，ITO)光敏電極，采用殼聚糖包埋和戊二醛交聯相結合的方法固定ChOx，這種復合的固定化方法能夠使光敏電極達到更好的酶固定效果。試驗表征了ITO/ SnO2NPs/PTh電極固定ChOx前后的形貌變化，考察了殼聚糖濃度、戊二醛濃度、固定時間對ChOx相對酶活力的影響，通過響應面優化出最佳的ChOx固定化條件，并研究了光敏電極固定化酶的重復利用性和貯存穩定性，對于生物酶光敏電極能夠更好的應用于食品中膽堿的光電化學檢測提供了一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ChOx(10 units/mg)、過氧化物酶(250 units/mg)，美國Sigma公司；殼聚糖，上海麥克林生化科技有限公司；ABTS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊二醛(分析純)，天津市大茂化學試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(分析純)，天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HITACHI S-4300掃描式電子顯微鏡(scanning eletrn microscope，SEM)，日本日立公司；UV-5100紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 光敏電極ChOx的固定

用移液槍將5 μL殼聚糖溶液轉移到自制的ITO/SnO2NPs/PTh電極表面，室溫干燥成膜。然后用pH 6.0的PBS洗滌，晾干。電極表面涂以5 μL戊二醛溶液，硬化30 min后，用pH 6.0的PBS洗滌電極干燥，并滴加5 μL ChOx溶液，室溫固定化反應一段時間。用去離子水沖洗備用。

1.3.2 ChOx活性的測定

參考HEINZE等[21]的分光光度法測定ChOx活性并稍作修改，過氧化物酶偶聯系統氧化ABTS會導致414 nm處吸光度增加，1單位ChOx的活性對應1 μmol/min ABTS的氧化。在試管中依次加入0.8 mL的PBS(50 mmol/L、pH 7.0)、0.1 mL的膽堿(0.5 mmol/L)、0.05 mL ABTS溶液(50 mmol/L)和1.3.1所制的ChOx固定化酶膜，然后加入0.05 mL的過氧化物酶溶液(25 U/mL)，所有溶液均采用50 mmol/L的PBS(pH 7.0)配制，混勻，25 ℃反應5 min，測定樣品在414 nm處吸光度，空白對照組添加滅活固定化酶膜，其余不變。設定同組酶活力最高的相對酶活力為100%，以同組最高酶活力為參照，計算出的比值為ChOx相對酶活力。

1.3.3 ChOx固定化單因素試驗

1.3.3.1 殼聚糖濃度對固定化ChOx相對酶活力的影響

在戊二醛質量分數為0.3%、交聯時間為1 h時，考察殼聚糖質量分數為0.2%、0.6%、1%、1.4%、1.8%對ChOx相對酶活力的影響。

1.3.3.2 戊二醛濃度對固定化ChOx相對酶活力的影響

在殼聚糖質量分數為1%、交聯時間為1 h時，考察戊二醛質量分數為0.05%、0.3%、0.55%、0.8%、1.05%對ChOx相對酶活力的影響。

1.3.3.3 固定時間對固定化ChOx相對酶活力的影響

在殼聚糖質量分數為1%、戊二醛質量分數為0.3%，考察固定時間為0.2、0.6、1、1.4、1.8 h對ChOx相對酶活力的影響。

1.3.4 響應面法優化固定條件

基于單因素試驗結果，以ChOx的酶活力為考察指標，根據Box-Behnken原理設計3因素3水平響應面試驗，因素和水平試驗設計見表1。

表1 響應面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.4 固定化酶的重復利用性

將固定化酶在相同條件下連續操作10次，測定ChOx相對酶活力。

1.5 固定化酶的貯存穩定性

分別取固定化酶保存于0～4 ℃冰箱中，每隔4 d取出測定兩者的殘余酶活力。

1.6 數據處理

所有樣品進行3次平行試驗，采用Excel 2016進行數據統計分析，計算其平均值和標準誤差；實驗數據以“均值±標準差”表示并使用Origin 9繪圖；通過Design-Expert 8.0.6軟件對光敏電極固定化ChOx條件進行優化。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 殼聚糖濃度對固定化酶活力的影響

如圖1所示，固定化ChOx相對酶活力隨殼聚糖濃度的增加而逐漸升高，在殼聚糖質量分數為1%時酶活力達到最大值，與其他濃度相對酶活力的差異是極顯著的(P<0.01)，隨著殼聚糖濃度的繼續增加而顯著降低。殼聚糖是無毒的，具有生物相容性，為酶提供天然的微環境，并且有利于電子在酶和電極之間穿梭，在電極的酶固定領域應用廣泛[22]。當殼聚糖的濃度較低時，ChOx的包埋不緊密，酶會逐漸泄露，所以包埋效果較差，固定化酶活力較低。當殼聚糖質量分數>1%時，溶液黏度過大，酶液分布不均勻，降低了ChOx對膽堿的催化速率，所以固定化酶的活性降低，殼聚糖的最佳質量分數選擇為1%。

圖1 殼聚糖濃度對固定化酶活力的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on the immobilized enzyme activity 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 戊二醛濃度對固定化酶活力的影響

如圖2所示，隨著戊二醛濃度的增加，固定化ChOx的相對酶活力呈先升高后降低的趨勢，當戊二醛質量分數為0.3%時，ChOx的相對酶活力達到最大值，與其他戊二醛濃度的相對酶活力具有極顯著差異(P<0.01)。戊二醛的濃度較低時，交聯度較低。包埋的不緊實，酶容易流失，所以酶的相對活力不高。當戊二醛的質量分數>0.3%時，戊二醛中的醛基具有較大的范德華力，可以與殼聚糖以及酶中的—OH、—NH3等基團共價結合形成共價鍵，占用了酶蛋白中的有效基團，影響了酶與底物的有效結合，進而降低了酶對底物的催化氧化效率，同時戊二醛也是一種變性劑，高濃度的戊二醛會使酶的活性部位發生改變，致使酶失活，所以ChOx的酶活力降低，這與HUANG等[23]研究結果相一致，戊二醛的最佳質量分數選擇為0.3%。

2.1.3 固定時間對固定化酶活力的影響

如圖3所示，隨著固定化反應時間的延長，ChOx的相對酶活力呈逐漸升高的趨勢，在固定化時間超過1 h時，酶活力有所降低。酶的固定量會隨著固定化時間的延長而逐漸增加，酶活力也隨之升高。當酶的固定時間為1 h時，酶的固定量趨于飽和，ChOx的相對酶活力達到最大值，與其他固定時間相對酶活力之間的差異是極顯著的(P<0.01)。隨著固定時間繼續延長，過長的固定時間會導致酶的交聯程度過高，增加了空間網絡結構的緊密程度，阻礙了底物的擴散，促使ChOx的相對酶活力略有降低，而且固定時間的延長也會導致酶的結構發生改變，酶活力也會隨之降低，這與PAN等[24]的研究結果相一致，因此選擇固定時間為1 h。

圖2 戊二醛濃度對固定化酶活力的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde concentration on the immobilized enzyme activity

圖3 固定時間對固定化酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilized time on the immobilized enzyme activity

2.2 電極上ChOx固定化的響應面分析

在單因素試驗的基礎上，以殼聚糖質量分數(A)、戊二醛質量分數(B)、固定時間(C)為自變量，以酶活力為響應值，進行響應面分析實驗，實驗結果見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件設計實驗方案，對實驗結果進行二次回歸方程的分析，可以得出，ChOx活力Y的二次回歸方程，并采用方差的方法分析(表3)可知。酶活力Y的標準回歸方程為：Y=16.72-0.14A+0.050B+0.013C-0.70AB+0.12AC+0.00BC-2.65A2+0.43B2-5.30C2。

模型的決定系數與調整決定系數分別為0.994 5、0.987 4，說明此模型與試驗之間擬合程度較高，證明用此模型優化殼聚糖濃度、戊二醛濃度和固定時間對固定化ChOx活力的影響具有可行性。由殼聚糖濃度、戊二醛濃度、固定時間對響應值的影響可以得出，回歸方程Y中的AB、A2、C2對固定化ChOx的酶活力都有極其顯著的影響，B2對固定化ChOx的酶活力有顯著的影響，而其他因素影響不是很明顯，表明各影響因素對于固定化ChOx活力的影響不是簡單的線性關系。用中心標準化處理回歸方程，Y回歸方程一次項回歸系數的絕對值大小依次為A、B、C，因此，3個影響因素對酶活力影響順序為：殼聚糖質量分數(A)>戊二醛質量分數(B)>固定時間(C)。

表2 響應面的實驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 酶活力試驗結果的方差分析表Table 3 ANOVA for the experimental results of enzyme activity

對模型中的殼聚糖質量分數(A)、戊二醛質量分數(B)、固定時間(C)其中的1個因素讓它在0水平不動時，由此可知，另外2個影響因素相互交叉作用對酶活力Y的子模型，并根據子模型，分別繪制出3個3維響應曲面圖，如圖4所示。

a-殼聚糖濃度和戊二醛濃度對酶活力的影響； b-殼聚糖濃度和固定時間對酶活力的影響； c-戊二醛濃度和固定時間對酶活力的影響圖4 固定化酶活力的響應面圖Fig.4 The response surface of immobilized enzyme activity

圖4說明了各因素對固定化ChOx活力的影響。由圖4-a、圖4-c可以看出，殼聚糖濃度和固定時間之間以及戊二醛濃度和固定時間之間交互作用較強，而殼聚糖濃度和戊二醛濃度之間交互作用較弱。并且由圖4-a、圖4-b可以看出，與殼聚糖濃度和戊二醛濃度相比，固定時間對酶活力的影響相對較小。

通過所得到的模型，可預測ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極固定ChOx的最佳工藝條件為：殼聚糖質量分數1%、戊二醛質量分數0.55%、固定時間1 h。在此條件下，固定化ChOx的酶活力在理論上可達17.3 U。

2.3 驗證實驗

根據上述結果進行近似驗證試驗，檢測真實值是否與試驗結果相一致。在最佳工藝條件下進行3次平行試驗，測得固定化ChOx活力為17.2 U，與理論值相比，相對誤差在±1%以內，而且重復性好，說明優化結果是準確可靠的。

2.4 光敏電極表征

圖5為ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極固定化ChOx前后的掃描電鏡對比圖。圖5-a中PTh在SnO2NPs表面呈塊狀均勻分布，形成1層藍色PTh膜；圖5-b中ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極固定化ChOx后，有層狀結構的蛋白質沉積于納米材料修飾的電極表面，表明酶已固定在PTh膜之上，因此ChOx被成功固定在光敏電極的表面。

a-ITO/SnO2 NPs/PTh；b-ITO/ SnO2 NPs/PTh/ChOx圖5 ITO/SnO2 NPs/PTh和ITO/ SnO2 NPs/PTh/ChOx 光敏電極掃描電鏡圖Fig.5 SEM of ITO/SnO2 NPs和ITO/ SnO2 NPs/ChOx photosensitive electrode

2.5 固定化酶的重復利用性

固定于ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極的ChOx的重復利用性如圖6所示，固定化的ChOx活性隨著使用次數的增多而略有下降，這是由于重復的操作會使酶的包埋強度降低，致使酶有所流失，從而降低了ChOx活性。在重復利用6次后，固定化ChOx可保持最高酶活力的90%，經過10次利用以后，固定化ChOx可酶活力仍然保持在83%以上，表明ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極上固定ChOx具有良好的重復利用性。與共價交聯法固定ChOx相比，酶活力的損失較小，重復利用多次后仍保證較高的酶活力[20]。

圖6 固定化Chox的重復利用性Fig.6 Reuse of the immobilized ChOx

2.6 固定化酶的貯存穩定性

固定于ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極的ChOx的貯存穩定性結果如圖7所示，隨著貯存時間的延長，固定化ChOx的酶活力略有降低，但總體下降幅度不大，20 d后ChOx的酶活力還能保持到86%，表明ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極上固定ChOx具有良好的貯存穩定性。與吸附法固定ChOx相比，反應更加溫和，載體不易脫落，具有更好的重復利用性[25]。

圖7 固定化Chox的貯存穩定性Fig.7 Storage stability of the immobilized ChOx

3 結論

為了實現新型光敏電極對食品中膽堿的快速檢測，根據ChOx對膽堿的特異性催化作用，探究光敏電極上ChOx的固定化方法。采用殼聚糖包埋與戊二醛交聯相結合的方法固定ChOx，以ChOx固定化酶活力的顯著影響因素殼聚糖濃度、戊二醛濃度、固定時間進行單因素試驗以及響應面分析，確定ChOx的最佳固定化條件為殼聚糖質量分數1%，戊二醛質量分數0.55%、固定時間1 h，在此條件下固定化Chox的酶活力為17.2 U，與理論值接近；SEM證明了ChOx成功固定于ITO/ SnO2NPs/PTh光敏電極的表面；光敏電極上固定化ChOx重復利用10次以后酶活力仍能保持83%，貯存20 d后酶活力仍能保持86%，具有良好的重復利用性和貯存穩定性，固定ChOx的光敏電極將應用于后續食品中膽堿的光電化學檢測之中。