堿處理對玉米秸稈固態厭氧消化過程中菌群結構的影響

張成明，李硯飛，董保成，劉曉玲，白耀博，曹丹，劉潔，李十中

1(徐州生物工程職業技術學院，徐州市生物制藥與廢棄物綜合利用工程中心，江蘇 徐州，221006)2(青縣新能源技術推廣中心， 河北 滄州，062650)3(農業農村部農業生態與資源保護總站，北京，100125)4(天津大學 化工學院，天津，300350) 5(中國環境科學研究院，北京，100012)6(清華大學 核能與新能源技術研究院，中美生物燃料聯合研究中心，北京，100084)

我國從2015年開始推廣大規模沼氣工程，以解決農業廢棄物及禽畜糞污帶來的污染問題[1-2]。其中，纖維質原料來源廣泛、收集、貯存便利，被很多沼氣工程用作生產原料。纖維質原料主要由纖維素、半纖維素和木質素等組成，其中纖維素和半纖維素可以被微生物降解并轉化為沼氣。但是，纖維質原料的結構特點使其降解效率較低。為了解決這一問題，研究者開發出了多種預處理手段。其中，堿預處理被認為具有很好的應用潛力。NaOH是堿預處理中最常用、性價比最高的試劑，在多種纖維質原料的預處理中均取得了良好效果[3-4]。玉米秸稈是沼氣工程最常用的原料之一。韓婭新等[5]報道，玉米秸稈中揮發性固形物比例較高，達到92.56%；其C/N比為31.88，基本處于厭氧消化的最佳C/N范圍內(20～30∶1)，優于水稻秸稈的61.59和小麥秸稈的78.47。這也是沼氣工程可以以玉米秸稈為唯一原料而穩定運行的原因[1]。

對于厭氧消化處理，除反應條件外，其性能主要取決于兩方面因素，一是物料自身的物理化學特性，二是沼氣發酵過程中的微生物菌群。研究表明，對纖維質原料進行堿預處理，可以達到解開交聯、增大物料多孔性、增加比表面積、降低纖維素的聚合度和結晶度、破壞木質素結構并部分溶解木質素等目的，進而提升了纖維質底物的厭氧消化性能[5-7]。在微生物菌群方面，近年來的研究主要集中在厭氧條件(如底物濃度、溫度等)及底物種類對微生物菌群的影響[8-14]。例如，蔣滔等[10]研究了玉米秸稈在固態及液態厭氧消化條件下微生物菌群的變化。青格爾等[14]研究了低溫條件下，玉米秸稈降解過程中的微生物組成。DE FRANCISCI等[8]則報道了底物組成對微生物群落的影響。

目前為止，圍繞預處理促進纖維質原料厭氧消化性能，以及研究厭氧消化過程中微生物群落動態變化的報道較多。但是，對比研究預處理組與對照組在菌群結構方面的差異報道較少[7]。本文重點分析了堿預處理對玉米秸稈固態厭氧消化過程中菌群變化的影響。

1 材料與方法

1.1 底物與接種物

玉米秸稈，耿忠生物技術有限公司，粉碎至40目以下；總固形物(total solids，TS)、揮發性固形物(volatile solids，VS)等組分見表1；厭氧污泥，某污水處理廠。

表1 玉米秸稈及厭氧消化污泥組分 單位：%

1.2 儀器與設備

SX-25-1馬弗爐、101-1ES電熱鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器有限公司；AMPTS II甲烷測定儀，瑞典碧普有限公司；BSA124S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 NaOH 預處理

用于玉米秸稈預處理的NaOH質量分數為6%(按玉米秸稈TS添加)，預處理過程含水量為90%，在30 ℃，100 r/min的條件下處理3 d。對照組不加NaOH，其余條件完全相同。

1.3.2 固態厭氧消化

處理后的玉米秸稈與污泥按質量比2.5∶1(以VS計)的比例進行混合接種，厭氧消化體系TS為15%，反應溫度(35±1)℃。用500 mL血清瓶作為反應器，發酵開始前通氮氣以保證厭氧環境。厭氧消化過程在AMPTS Ⅱ甲烷測定儀中進行。沼氣用3 mol/L NaOH吸收二氧化碳等氣體，獲得的產氣量即為甲烷產量。以未經NaOH預處理的玉米秸稈作為對照的原料，兩組分別設置3個平行。

1.3.3 DNA提取方法

根據預實驗選定取樣時間，樣品先用改進后的TENP buffer進行預處理[11]。具體步驟：取0.25 g樣品加入到2 mL滅菌離心管，加1.5 mL TENP buffer，振蕩3 min，室溫下12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。再重復上述步驟洗滌1次。接著用1 mL PBS buffer洗滌，在室溫下12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，再重復洗滌1次。然后加1 mL滅菌后的蒸餾水洗滌1次。最后用Fast DNA Spin Kit for soil(MP Biomedicals，Shanghai，China)試劑盒，按說明書步驟提取菌群總DNA。

1.3.4 宏基因組測序

DNA 樣品由諾賽基因組研究中心將檢測合格的環境DNA樣品經過片段化、片段篩選、建庫并做相應的檢測。檢測合格的文庫將采用Illumina Miseq/Hiseq高通量測序平臺進行測序，測序得到的數據用于后期生物信息學分析。實驗中對細菌及古菌均進行了測定。

1.3.5 取樣點設計

根據日產氣特性，將厭氧消化階段分為產氣高峰期、產氣穩定期和產氣末期3個階段；對應的取樣時間分別為第2、10、25天。為了更好地理解堿處理后厭氧消化過程的菌群變化，在產氣高峰期增加了第1和第3天兩個取樣點。

2 結果與分析

2.1 NaOH預處理對玉米秸稈固態消化產氣性能的影響

實驗首先分析了預處理對玉米秸稈固態消化產氣性能的影響。預處理后，玉米秸稈的累積甲烷產率由101.8 mL/g TS提高到149.0 mL/g TS，提高約46.3%(圖1)。該現象與其他研究者得到的結果類似[5]。從整個發酵過程看，NaOH預處理組和對照組的日產氣趨勢十分相似，都經歷3個比較明顯的階段：產氣高峰期(第1階段)、產氣穩定期(第2階段)和產氣末期(第3階段)。與對照組相比，預處理組在階段1產氣高峰的峰值更高[30.2 mL/(g TS·d)]；而且每個階段持續的時間都更短(圖2)。根據產氣規律，分別選擇有代表性的時間點，第1、2、3、10、25天的菌群作為研究目標。

a-對照；b-堿處理圖1 堿處理對玉米秸稈固態厭氧消化中累積 甲烷產率的影響Fig.1 Effect of alkali treatment on the cumulative methane yield in solid-state AD of corn straw

2.2 NaOH預處理對玉米秸稈固態厭氧消化過程中菌群變化的影響

2.2.1 堿處理后厭氧消化過程中門水平菌群結構的變化

初始菌群(即接種污泥)中，變形菌門(Proteobacteria)、廣古菌門(Euryarchaeota)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)占據較大優勢，且不同門之間的相對豐度差異較小。在整個厭氧消化過程中，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和廣古菌門這4個門微生物的相對豐度始終占據主導位置，且豐度明顯高于其他門的微生物(圖3)。

a-對照；b-堿處理圖2 堿處理對玉米秸稈固態厭氧消化中日甲烷產率的影響Fig.2 Effect of alkali treatment on the daily methane yield in solid-state AD of corn straw

L-菌群；S-固態；A-堿處理；0、1、2、3、10、25-取樣時間圖3 堿處理玉米秸稈固態厭氧消化過程中菌群 門水平的動態變化Fig.3 Dynamic changes of microbial community during solid-state AD of alkali treated corn straw at phylum level

發酵開始后，厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度急劇上升至28%和18%；從發酵第3天起，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度有一些下降，然后基本保持穩定，維持在17%左右。厚壁菌門和擬桿菌門的微生物在厭氧消化反應器中廣泛存在，主要與底物水解和產酸過程相關。初始菌群中占主導地位的變形菌門和廣古菌門的相對豐度呈現了相反的規律，即先下降，后上升并維持穩定。發酵進行至第2天，變形菌門和廣古菌門的相對豐度分別下降至10%和5%；隨后它們的相對豐度開始上升，基本達到初始菌群中的水平。

初始菌群中，其他門的微生物數量較少，并呈現出不同的規律。Chloroflexi、Aminicenantes、熱袍菌門(Thermotogae)的相對豐度在整個消化過程中持續下降，并最終維持穩定，說明這些微生物不適合秸稈為底物的厭氧消化系統；Actinobacteria在消化過程中，數量波動較大；浮霉菌門(Planctomycetes)在消化過程中，數量基本維持穩定；Spirochaetes先是持續下降，但到發酵末期有1個明顯上升。

2.2.2 堿處理與對照組厭氧消化菌群門水平的結構差異

實驗中比較了堿處理組與對照組的微生物差異，以觀察堿處理對菌群變化的影響(圖4)。2個實驗組微生物菌群的差異主要體現在厚壁菌門和擬桿菌門上。厚壁菌門中有許多高效纖維素降解菌屬[如梭菌屬(Clostridium)]，它在堿處理組LS-A-2和LS-A-10中的豐度(29%和17%)遠遠高于對照組的LS-2和LS-10(9%和6%)。而Bacteroidetes的情況恰恰相反，它在對照組中更活躍，在LS-2和LS-10中相對豐度分別是32%和23%，而在堿處理組LS-A-2和LS-A-10中均為18%。

L-菌群；O-原始菌群；S-固態；A-堿處理；0、2、10、25-取樣時間圖4 堿處理與對照組玉米秸稈固態發酵過程中菌群 在門水平的比較Fig.4 Comparison of microbial community structure during solid-state AD of corn straw in alkali treatment and control group at phylum level

堿處理可以改變相同底物時厭氧消化系統中微生物在門水平的分布。厚壁菌門和擬桿菌門分別是堿處理組和對照組中最具優勢的微生物。對照組的微生物呈現出了更好的多樣性。兩組實驗中，數量最多的微生物門類依次為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和廣古菌門。這與其他以纖維質原料為底物(或主要底物)時的菌群結構相似[13-16]。王旭輝等[13]報道，玉米秸稈與牛糞聯合厭氧消化時，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是細菌中最具優勢的門類。青格爾等[14]以玉米秸稈為底物，利用不同氮源對低溫高效降解復合菌系GF-20進行了馴化。經過連續培養10代發現，變形菌門和擬桿菌門的微生物最具優勢。FENG等[15]報道，玉米秸稈與雞糞聯合厭氧消化時，廣古菌門、擬桿菌門、厚壁菌門是優勢菌群。這些研究充分說明了厭氧消化底物種類對微生物菌群結構具有顯著影響。

2.2.3 堿處理后厭氧消化過程中菌群結構屬水平的變化

微生物在門水平上的代謝特性差異較大，因此，在屬水平上對微生物群落變化進行了分析。實驗中主要鑒定出16個屬的微生物，結果如圖5所示。擬桿菌屬(Bacteroides)、Clostridium、甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Lachnoclostridium是實驗條件下的主要微生物。除Methanosaeta外，其他屬的微生物在消化過程中的豐度變化均十分顯著(圖5)。其中，Bacteroides和Clostridium在消化過程中顯著增加了。

圖5 堿處理玉米秸稈固態厭氧消化過程中菌群屬水平的 動態變化Fig.5 Dynamic changes of microbial community during solid-state AD of alkali treated corn straw at genus level

第1階段，大部分屬的生物量均顯著增加。在第2天，Bacteroides和Clostridium的相對豐度分別從5%急劇上升到了17%和11%。Lachnoclostridium和Pseudomonas的豐度分別由0.65%和0.3%上升至2.8%和7%。Methanosaeta變化趨勢較為特殊，發酵前2 d時，其相對豐度從13.5%降到8.7%，然后提升至26%。第2階段時，厭氧消化菌群在屬水平的組成結構非常接近，其中具備纖維素降解能力的微生物優勢明顯。例如，Bacteroides(7%～11%)、Clostridium(約4%)、Methanosaeta(22%～25%)、分支桿菌屬(Mycobacterium)(約5%)和瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)(約3%)。Mycobacteria豐度變化與Methanosaeta的變化趨勢高度一致。Methanosaeta在所有產甲烷菌中占絕對優勢(約80%)，因此乙酸途徑可能是此厭氧發酵過程中主要的產烷途徑。第3階段，微生物的總體數量下降更明顯，豐度仍能保持甚至提高的菌屬主要有Methanosaeta(約18%)，Clostridium(約5%)，Ruminiclostridium(約3%)和Lachnoclostridium(約2%)。除了Methanosaeta其他菌種基本都是具備纖維素降解能力的微生物。研究者對這些微生物降解纖維素的機制、關鍵基因識別和表達等方面，均進行了深入的研究[16-19]。

2.2.4 堿處理與對照組厭氧消化菌群屬水平的結構差異

從屬水平看(圖6)，發酵第2天堿處理組中Clostridium、Lachnoclostridium和Cellulosilyticum等纖維素降解菌的豐度(分別為11%、3%和2%)遠高于對照組LS-2(分別為2%、0.4%和0.6%)。產生這種差異的原因可能是堿處理后玉米秸稈中的纖維素更容易被纖維素降解菌降解，進而促進了纖維素降解菌的生長。第10天時，對照組與堿處理組的菌群結構差異縮小。堿處理組中，具備纖維素降解能力的微生物更具備豐度上的優勢。另外，Methanosaeta的豐度在2個實驗組中的差異被放大了，分別為21.7%(堿處理組)和9.4%(對照組)，這應該是由可利用底物的多寡不同引起的。第25天時，菌群結構差異進一步縮小。在這一階段，能夠利用的底物幾乎被降解完全，堿處理對底物可降解性的促進作用減小。

圖6 堿處理組與對照組玉米秸稈固態發酵菌群屬水平比較Fig.6 Comparison of microbial community structure during solid-state AD of corn straw in alkali treatment and control group at genus level

初始菌群中共鑒定出16個屬的微生物。它們的豐度由初始的29%上升至51%～60%，在發酵末期下降至42%，但仍比初始相對豐度提高了43%。在厭氧消化過程中，Methanosaeta、Bacteroides、Clostridium均占據顯著優勢。兩組實驗中，能夠利用纖維素的微生物均更具優勢，堿預處理進一步強化了這些微生物的優勢，這些微生物主要包括Bacteroides、Clostridium、Mycobacterium和Ruminiclostridium。

3 結論

底物種類可以顯著改變菌群結構。采用玉米秸稈為底物時，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和廣古菌門均是主要的微生物門類。堿預處理可以在門水平改變微生物的菌群結構。堿處理組及對照組中最具優勢的微生物門類分別是厚壁菌門和擬桿菌門。從屬水平上看，對照組鑒定出的各屬的豐度相對較為平均，呈現出了多樣性；從屬水平看，堿處理后，厭氧消化過程中水解產酸菌和產甲烷菌的相對豐度都更高，包括Clostridium、Lachnoclostridium、Cellulosilyticum和Methanosaeta。甲烷菌中，Methanosaeta占據優勢，這表明在本研究條件下，乙酸途徑是產甲烷的主要途徑。本文研究表明，在纖維質原料預處理方式選擇上，不應只考慮物料本身的理化性質，更要從微生物菌群角度進行考慮。