宏觀氣候條件下固態發酵糟醅中雜醇油生成規律的分析

施思，喬宗偉, 2*，鄭佳, 2，羅青春，廖勤儉，劉多濤

1(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644007)2(中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室，四川 宜賓，644007)

雜醇油主要是指3個碳以上一元醇物質的總稱，是白酒中的芳香成分，但同時它還是白酒苦味或澀味的主要來源之一，當雜醇油含量過高時，會導致低度白酒渾濁，影響白酒質量，飲酒后會產生上頭，不適等癥狀。其中，異戊醇和異丁醇對人體影響最大。因此，控制雜醇油含量是改善基酒口感的必要措施。目前，許多學者的研究工作表明，雜醇油的生成與微生物代謝和生產工藝密切相關，并在降低雜醇油生成方面做了許多探索。在基礎研究方面，通過基因工程[1-5]、誘變育種[6-9]等技術選育低產雜醇油菌株，進一步解析了雜醇油生成的有關機理；但由于其在遺傳穩定性方面存在缺陷，且對生產環境中其他微生物生長代謝的作用情況不明。因此，人工選育出的低產雜醇油菌株在實際應用方面的可行性當前來看并不大。在應用研究方面，蒸餾裝備的改良和蒸餾條件的優化可有效地降低雜醇油的含量，但有可能造成其他香味成分的損失，且重新改良和打造適宜的蒸餾裝置會投入大量成本，難以大規模推廣使用[10-12]。

固態發酵白酒有多種香型之分，但無論濃香、醬香還是清香，都是采用開放式、多微共生共酵的生產方式，白酒的釀造品質和風格與產區大氣候及其所造就的微生物圈密切相關。生產上常通過上一輪糟醅生酸和產酒的情況，結合當天的氣溫調整下一輪的糟醅結構，因此降低雜醇油的含量需要從產區和生產操作的實際情況出發，建立一套實用合理，且易推廣應用的發酵工藝。這項工作需要對固態白酒中相關雜醇油的含量與分布規律進行摸索，并與生產中工藝控制的常規要素進行關聯性分析，最終通過糟醅中酸、溫、氣、水、構的協調匹配，達到合理調控雜醇油生成的目的。

本試驗自制磚窖作為固態白酒發酵設備，在2年時間中跟蹤檢測了共計30輪次的糟醅發酵數據，探討了異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇的生成規律，為特定產區雜醇油生產調控提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區域氣候概況

宜賓地處“中國白酒金三角”核心區，位于四川盆地南緣，四川、云南、貴州3省交界處。它是長江上游重要的生態屏障，屬于亞熱帶濕潤季風氣候，適宜微生物生存，形成獨特的釀酒環境。宜賓市年平均降雨量達1 200 mm，氣候溫和，年平均氣溫17.6 ℃，年平均日照1 018.2 h。晝夜溫差小，濕度大，非常有利于釀造原料的生長。它是同緯度地區農作物生長的最佳氣候區之一。在海撥高度、地理位置和大氣環流的共同作用下，宜賓市既有四川盆地中亞熱帶濕潤氣候的特色，又有山地垂直氣候變化的規律，具有從南亞熱帶到溫暖帶的立體氣候特征[13]。氣候是決定一個地區熱量和水量的基本條件。宜賓五糧液產地常年溫差和晝夜溫差小、濕度大、日照時間短，形成冬暖夏熱的特殊氣候[14]。

1.2 材料與試劑

釀酒原料：高粱、小麥、大米、糯米、玉米，國產市售；酚酞、NaOH，均為國產分析純；異戊醇、正丁醇、異丁醇、正丙醇，均為色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

7890氣相色譜儀[配備火焰離子檢測器(flame ionization detector，FID)檢測器]，美國安捷倫公司；磚窖：長×寬×高約為2.5 m×1.8 m×1.2 m。

1.4 試驗方法

1.4.1 發酵方法

試驗采用續糟發酵，每輪發酵結束后添加一定比例的曲粉，混勻后重新入窖。糟醅發酵體系分為上、中、下3層，每層糟醅約為1 200 kg，發酵周期為40 d。入窖前，檢測每層糟醅酸度及入窖溫度；發酵結束后，分層起糟，檢測每層出窖糟酸度。試驗發酵共計30輪次。

1.4.2 糟醅酸度的檢測方法

取糟醅試樣20.0 g于250 mL燒杯中，加入200 mL純凈水攪拌均勻，于室溫下浸泡30 min，前15 min勤攪拌，后15 min靜置。吸取20.0 mL上清液于250 mL三角瓶中，環瓶壁加入20 mL純凈水。加入酚酞指示劑2滴，以0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微紅色為其終點。酸度表示為10 g糟醅消耗NaOH標準溶液的毫摩爾數。

1.4.3 異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇含量分析

發酵結束后，用甑子蒸餾，每一甑裝載量對應一層糟醅量，每甑糟醅蒸餾完畢后取樣分析，用氣相色譜檢測雜醇油含量。氣相色譜檢測條件為，色譜柱：Agilent19095N-123毛細管柱(0.530 mm×30 m，1 μm)；色譜柱溫度：初始溫度35 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升到180 ℃，保持1 min；載氣N2；流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃；進樣量10 μL；分流比20∶1[15]。

1.4.4 基酒產量分析

試驗采用實際的基酒產量反映糟醅中的乙醇發酵程度，每甑裝載量為一層糟量，每甑糟醅蒸餾完畢后收集基酒稱重。產量越高，則乙醇發酵越充分。

1.4.5 數據分析

使用GraphPad Prism 9進行單因素方差分析，多變量相關性分析及主成分分析(principal component analysis，PCA)。在執行PCA過程中，由于變量單位不統一，選擇標準化數據(standardized data)，并通過并行分析(parallel analysis)來選擇成分數量。

2 結果與分析

2.1 入窖溫度

環境是微生物生長代謝的重要因素，而環境溫度是生產工藝控制的關鍵。其中，入窖溫度在所有調控因素中起支配作用，其他要素均需要根據入窖溫度的變化而變化。入窖溫度和氣候變化密切相關，主要由地溫決定，正是因為入窖溫度的因素，傳統固態釀造生產有了冷季和熱季之分[16]。秉持釀酒生態與自然生態相契合的原則，遵循客觀氣候條件，試驗采用自然鼓風和攤晾調節入窖糟溫度(圖1)。其中，15～22 ℃有18批次，23～29 ℃有12批次。試驗經歷了從冷季到熱季的自然轉換。

圖1 不同糟層入窖溫度Fig.1 The temperature of different Zaopei layers before fermentation

2.2 糟醅酸度變化

酸度變化顯示了每一批次、不同糟層的生酸情況。酸度在生產工藝上是一個重要指標，入窖酸一般采用加糧，加水等操作進行調控。酸度的變化體現了糟醅發酵體系中微生物的演替過程，一般情況下，糟醅生酸多，會形成酸多酒少的結果；糟醅生酸少時，有利于酵母發酵產酒，有利于下一輪的發酵。如圖2所示，本試驗發酵周期為40 d，生酸幅度主要集中在0.5～1.5。通過方差分析顯示，不同糟層之間酸度變化無差異(P=0.168 5)，而不同批次之間酸度變化極為顯著(P<0.001)。

2.3 不同糟層乙醇發酵分析

為緊貼實際生產操作要素，本試驗使用基酒產量反映實際生產過程中乙醇的發酵情況，乙醇發酵越好，產酒越多。每甑裝載量為一層糟量，蒸餾完畢后，收集的基酒可完全反映每層糟醅的乙醇發酵情況。如圖3所示，試驗發酵周期為40 d，基酒產量范圍主要集中在20～40 kg/甑。

圖2 不同糟層的酸度變化Fig.2 The acidity change of different Zaopei layers

圖3 不同糟層基酒產量Fig.3 The liquor yield of different Zaopei layers

2.4 不同糟層中4種雜醇油的分布

發酵結束后，用甑子蒸餾，每一甑裝載量對應一層糟醅量，每甑基酒收集完畢后，取樣分析，分析結果可完全反映每一層糟醅中雜醇油的生成情況。表1顯示了異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇在不同糟層中的含量和分布情況。從總體生成量來講，正丙醇>正丁醇>異戊醇>異丁醇；方差分析結果表明，異戊醇、正丙醇和正丁醇在空間分布上具有顯著差異，其中正丙醇和正丁醇分布規律較為一致，兩者在下層糟醅中含量顯著提高，分別為210.4 mg/100mL和114.2 mg/100mL，而異戊醇的分布規律則為從上至下，逐漸升高；異丁醇在4種雜醇油中，生成量最少，且在空間分布上無顯著差異。

表1 異戊醇、異丁醇、正丙醇、正丁醇在不同空間層面的分布 單位：mg/100mL

2.5 不同糟層中4種雜醇油和工藝要素的相關性分析

對不同糟層中4種雜醇油的生成情況同生酸、產酒和入窖溫度進行相關性分析，各變量的相關系數如表2所示，上層糟醅中異戊醇含量與酸度，入窖溫度呈極顯著負相關(P<0.01)，與基酒產量呈極顯著正相關(P<0.01)；下層糟醅中正丁醇含量與基酒產量呈顯著負相關(P<0.05)，與酸度和入窖溫度呈顯著正相關(P<0.05)等。相關性系數中，|r|>0.3，P<0.05的數據有26個，占整體相關系數的72.2%。結果表明各變量之間相關性較強，可通過PCA對各變量之間的關系進行進一步解析[17]。

表2 異戊醇、正丙醇、正丁醇和異丁醇與酸度變化、 基酒產量和入窖溫度的相關性分析Table 2 The correlation analysis of isoamyl alcohol, n-propanol, n-butanol and isobutanol with acidity change, liquor yield and temperature

2.6 雜醇油和工藝要素的PCA

表3顯示，經PCA共提取了5個主成分，其中主成分1貢獻率最大，占比41.80%，表明主成分1對發酵體系中各變量的影響最大。前3個主成分特征值均>1，累計貢獻率為84.93%，基本可以反映各變量相互影響的大部分信息。故選取前3個主成分作為數據分析的有效成分。

表3 主成分的特征值與貢獻率Table 3 Eigenvalue and their contribution of principal components

前3個主成分的特征向量與載荷矩陣如表4所示。載荷值反映了各變量與主成分間的相關系數，載荷值的絕對值越大，表明該變量對主成分影響越大，正號表示為正向影響，而負號表示為負向影響[18-19]。表4的分析結果顯示，雜醇油成分中，對主成分1貢獻度最大的是異戊醇和異丁醇，其次為正丁醇和正丙醇；其中，異戊醇和異丁醇對主成分1的影響為正相關，正丙醇和正丁醇對主成分1的影響呈負相關。在生產工藝控制要素方面，酸度變化和入窖溫度與主成分1呈負相關，且入窖溫度的絕對影響值更高。

表4 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 4 Eigenvectors and loading matrix of principal components

在圖4中，箭頭的長度反映了變量信息丟失程度，箭頭的程度越長，則變量信息在分析過程中丟失越少[20]。不同變量間距離越長表明差異越大，距離越短則說明相關性越高[21]。由圖4可知，7個變量分布在了3個不同的象限。酸度變化和入窖溫度分布在第2象限，正丙醇和正丁醇分布在第3象限，而基酒產量和異戊醇和異丁醇分布在第4象限?；飘a量在一定程度上可反映糟醅中乙醇發酵的強度，和異戊醇，異丁醇的特征向量為正，處在主成分1的正向分布上；酸度變化反映糟醅中的產酸代謝，它與入窖溫度密切相關，兩者和正丙醇，正丁醇的特征向量為負，分別排列在主成分1的負軸方向。由于主成分1對變異分析的貢獻度最大，因此可以推測出正丙醇，正丁醇主要與酸調控相關；異戊醇和異丁醇的生成主要與乙醇發酵有關。且兩組雜醇油的調控策略相反：即溫度偏高時，生酸較多，影響乙醇發酵，基酒產量減少，可能會降低異戊醇和異丁醇的生成，但正丙醇和正丁醇含量增加；當溫度偏低時，生酸緩，酸度低，會促進乙醇發酵，增加基酒產量，正丙醇和正丁醇生成量減少，但異戊醇和異丁醇含量可能會偏高。因此，在生產上掌握調控的平衡是至關重要的。

圖4 載荷圖Fig.4 Loading diagram

3 結論

本研究在2年時里跟蹤了30輪次固態發酵糟醅中異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇的生成規律，生成量最多是正丙醇，其次為正丁醇、異戊醇和異丁醇；正丙醇(P<0.001)、正丁醇(P<0.01)和異戊醇(P<0.01)在不同糟層中的分布具有顯著差異，分布規律為下層>中層>上層；異丁醇在不同糟層中的分布無顯著差異(P>0.05)。4種雜醇油與入窖溫度、酸度變化和基酒產量的相關性及主成分分析結果表明，溫度和生酸與正丙醇和正丁醇的生成呈正向影響，與異戊醇和異丁醇的生成呈負向影響；基酒產量在一定程度上反映了乙醇的發酵強弱，它與異戊醇、異丁醇的生成呈正向影響；在工藝要素方面，酸度變化與入窖溫度呈正相關，兩者與基酒產量呈負相關。主成分分析是一種強大的探索性模型，在多個變量同時存在的情況下，降低數據維度，進行主要特征提取，是一種可靠的數理統計分析方法。通過主成分分析，初步弄清了4種雜醇油與溫度、生酸、產酒之間的關系，且控酸、控溫等參數易在生產操作中進行調控，為建立實用易推廣的雜醇油調控工藝奠定了基礎。