常壓室溫等離子體誘變選育生香型Kluyveromyces marxianus

王偉雄，胡少坤，古麗米熱·祖努納，黎進(jìn)雪，王妍凌，呂澤，杜展成，張海軍，武運(yùn)*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆芳香莊園酒業(yè)股份有限公司，新疆 和碩，841200) 3(吐魯番樓蘭酒莊股份有限公司，新疆 吐魯番，838201)

非釀酒酵母廣泛存在于葡萄的種植環(huán)境和發(fā)酵環(huán)境中[1]，相關(guān)研究表明，采用控制接種釀酒酵母和非釀酒酵母混合發(fā)酵是提高葡萄酒復(fù)雜度和增強(qiáng)葡萄酒獨(dú)特性的有效方法[2-3]，非釀酒酵母中的某些代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄酒的香氣具有重要貢獻(xiàn)[4]。由非釀酒酵母菌產(chǎn)生的天然抗菌劑可以有效抑制腐敗微生物，確保葡萄酒發(fā)酵進(jìn)程平穩(wěn)進(jìn)行，對(duì)于提升葡萄酒品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)[5-7]。但在葡萄酒釀造過(guò)程中由于非釀酒酵母發(fā)酵能力弱[8]、耐受性差[9]，導(dǎo)致其參與發(fā)酵周期短，對(duì)葡萄酒品質(zhì)影響較小，且商業(yè)酵母種類單一[10]，制約了葡萄酒風(fēng)味的多樣性。

常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma，ARTP)原理是ARTP產(chǎn)生的高濃度活性粒子能夠使DNA單鏈或雙鏈發(fā)生斷裂，造成DNA損傷，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)應(yīng)急修復(fù)機(jī)制，引起微生物突變[11]。該項(xiàng)技術(shù)具有突變效率高、安全性高等特點(diǎn)[12]，目前ARTP誘變育種研究已日趨成熟，在食品、藥品、飼料等產(chǎn)業(yè)均有應(yīng)用[13-14]。

從葡萄酒風(fēng)味多樣性角度出發(fā)，結(jié)合非釀酒酵母耐受性方面存在的問(wèn)題，本研究以從葡萄皮表面篩選的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)YK為研究對(duì)象，采用ARTP誘變育種技術(shù)對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行改良，以高耐受性為初篩標(biāo)準(zhǔn)對(duì)誘變菌株進(jìn)行初篩，以高產(chǎn)酸、產(chǎn)酯為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)對(duì)誘變菌株進(jìn)行產(chǎn)香復(fù)篩，最終獲得高耐受性產(chǎn)香非釀酒酵母，并對(duì)遺傳穩(wěn)定性，發(fā)酵能力，產(chǎn)香能力進(jìn)行驗(yàn)證。后期將用篩選獲得的非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵，以期打破葡萄酒品質(zhì)單一性這一局面，為非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的應(yīng)用提供理論技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)YK，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院食品生物發(fā)酵與質(zhì)量安全研究室。

1.1.2 化學(xué)試劑

無(wú)水乙醇、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀，名人生物科技有限公司；L(+)酒石酸，寧波金展生物科技有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，上海藍(lán)季生物科技發(fā)展有限公司；酚酞，天津市化學(xué)試劑三廠，以上實(shí)際均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基、TTC下層培養(yǎng)基配制方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]。

YPD培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ⅡS型ARTP誘變儀，無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；PTX-FA210型分析天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HR40-A2型生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；MJX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1810型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LE2002E電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ARTP誘變?cè)囼?yàn)

試驗(yàn)參數(shù)：參照文獻(xiàn)[16]中方法進(jìn)行設(shè)置。

1.3.2 致死率計(jì)算

致死率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 高耐受性非釀酒酵母初篩

1.3.3.1 TTC培養(yǎng)基篩選

選取YPD固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落誘變菌株并重新接種到新的YPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，48 h后將TTC上層培養(yǎng)基傾覆在TTC下層培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 h后觀察顯色情況，篩選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的誘變菌株。

1.3.3.2 菌株發(fā)酵能力測(cè)試

采用杜氏小管發(fā)酵法, 將上步篩選的突變菌株, 以4%的接種量分別接種裝有杜氏小管和10 mL YPD液體培養(yǎng)基試管中，28 ℃條件下培養(yǎng), 測(cè)定菌株產(chǎn)氣能力,篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。

1.3.3.3 菌株耐受性篩選

將上步篩選得到的突變菌株分別接種于不同葡萄糖質(zhì)量濃度(220、240、260、280 g/L)、SO2質(zhì)量濃度(40、50、60、70 mg/L)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(2%、4%、6%、8%)、pH值(2.5、3.0、3.5、4.0)的YPD液體培養(yǎng)基，接種量1×107CFU/mL，28 ℃培養(yǎng)24 h后在600 nm下測(cè)量吸光度，以不接種菌株的YPD液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3.4 產(chǎn)香非釀酒酵母復(fù)篩

總酯、總酸測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。

1.3.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將最終篩選得到的誘變菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，每一代菌株以4%的接種量接種于糖度為22.5 °Bx葡萄汁中28 ℃培養(yǎng)8 d，測(cè)誘變菌株產(chǎn)酒精能力和產(chǎn)酯產(chǎn)酸能力，驗(yàn)證誘變菌株遺傳穩(wěn)定性。

1.3.6 發(fā)酵能力驗(yàn)證

葡萄酒酒精度的測(cè)定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定。

1.3.7 產(chǎn)香能力驗(yàn)證

感官分析方法具體參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。品評(píng)小組由11名專業(yè)人員組成。在分析過(guò)程中，將酒樣隨機(jī)編號(hào)，每一個(gè)酒樣重復(fù)2次品評(píng)，對(duì)香氣特征進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)描述，并進(jìn)行量化。使用5分制對(duì)香氣強(qiáng)度進(jìn)行打分，強(qiáng)度越高分值越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變時(shí)間的確定

原始菌株YK經(jīng)ARTP誘變后致死率曲線如圖1所示。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，致死率也在隨之增大。當(dāng)誘變時(shí)間為100 s時(shí)，致死率達(dá)到93.25%，誘變時(shí)間為120 s時(shí)，致死率達(dá)到100%，未發(fā)現(xiàn)有活菌存在。當(dāng)致死率>90%時(shí)，菌株突變概率較高，突變幅度較大[19]。因此，選擇ARTP誘變時(shí)間100 s為本試驗(yàn)的最佳誘變時(shí)間。

圖1 不同輻照下菌株YK致死率Fig.1 Lethality of YK strains after ARTP

2.2 高耐受性非釀酒酵母初篩

2.2.1 TTC培養(yǎng)基篩選

TTC作為一種顯色劑，在培養(yǎng)基上顏色的深淺反應(yīng)菌株產(chǎn)酒精能力的強(qiáng)弱。產(chǎn)酒精能力越強(qiáng)的菌株，其呼吸酶的活力越旺盛，在顯色培養(yǎng)基上的顏色就越深。將通過(guò)ARTP誘變獲得的35株誘變菌株分別接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，以原始菌株YK作為對(duì)照，顯色情況如表1所示。原始菌株YK呈粉色，說(shuō)明顯色為紅色的菌株YK-1，YK-8，YK-17，YK-24，YK-27，YK-28，以及深紅色的菌株YK-7，YK-12，YK-13，YK-14，YK-20，YK-21，YK-29產(chǎn)酒精能力較原始菌株均有所增強(qiáng)，將篩選得到的13株誘變菌株進(jìn)行發(fā)酵能力篩選試驗(yàn)。

表1 ARTP誘變菌株顯色結(jié)果Table 1 Colour result of ARTP mutagenesis strain

2.2.2 杜氏小管發(fā)酵能力篩選

將上步篩選得到的13株誘變菌株接種在裝有杜氏小管的試管中，產(chǎn)氣情況如表2所示。誘變菌株YK-1，YK-8，YK-12，YK-13，YK-24培養(yǎng)8 h就觀察到有氣體產(chǎn)生，說(shuō)明誘變菌株起酵能力迅速，且YK-1，YK-8，YK-12起酵能力要優(yōu)于另外2株；培養(yǎng)12 h后誘變菌株YK-7，YK-21，YK-27未起酵，其余菌株均有氣體產(chǎn)生且YK-1，YK-29發(fā)酵能力強(qiáng)，已在杜氏小管中產(chǎn)生4/5氣體；培養(yǎng)24 h后誘變菌株YK-1，YK-29杜氏小管充滿氣體已完全浮在液面上；培養(yǎng)36 h原始菌株YK，誘變菌株YK-28杜氏小管充滿氣體，YK-8，YK-12，YK-13，YK-27發(fā)酵能力相同，已產(chǎn)生4/5氣體；48 h后除誘變菌株YK-7，YK-20，YK-24未能將杜氏小管中充滿氣體其余菌株均充滿氣體。綜合考慮誘變菌株YK-14，YK-17，YK-21，YK-27前期起酵速率慢發(fā)酵能力弱，因此選擇YK-1，YK-8，YK-12，YK-13，YK-28，YK-29起酵能力快，發(fā)酵能力強(qiáng)的菌株作為耐受性篩選出發(fā)菌株。

2.2.3 乙醇耐受性篩選

非釀酒酵母對(duì)乙醇具有較低的耐受性，參與葡萄酒發(fā)酵周期較短[20]。因此，篩選高酒精耐受性非釀酒酵母，提高非釀酒酵母存活時(shí)間，可以為葡萄酒貢獻(xiàn)更多的風(fēng)味物質(zhì)。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株活性影響如圖2所示。乙醇體積分?jǐn)?shù)在4%以內(nèi)，原始菌株YK表現(xiàn)出較高的乙醇耐受性，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于4%時(shí)，耐受性均低于其他誘變菌株；誘變菌株YK-1，YK-28，YK-29對(duì)乙醇的耐受性整體優(yōu)于誘變菌株YK-8，YK-12，YK-13；乙醇體積分?jǐn)?shù)在6%以內(nèi)，誘變菌株均能正常代謝生長(zhǎng)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)到8%時(shí)，6株誘變菌株生長(zhǎng)代謝均受到了不同程度的抑制，其中菌株YK-8，YK-12，YK-13代謝緩慢，YPD液體培養(yǎng)基菌液輕微渾濁。

表2 杜氏小管產(chǎn)氣結(jié)果Table 2 Du′s tubule gas production result

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株代謝的影響Fig.2 Effect of different ethanol volume fraction on metabolism of strain

2.2.4 二氧化硫耐受性篩選

二氧化硫作為一種在葡萄酒中重要的食品添加劑被廣泛使用，在葡萄酒中具有殺菌增酸等多種作用[21]。將原始菌株及誘變菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)情況如圖3所示。原始菌株YK及誘變菌株均表現(xiàn)較高的耐受性，代謝生長(zhǎng)旺盛，菌液渾濁。二氧化硫質(zhì)量濃度在60 mg/L以內(nèi)時(shí)，菌株耐受性YK-28>YK-29>YK>YK-8>YK-12>YK-1>YK-13。

圖3 不同二氧化碳質(zhì)量濃度對(duì)菌株代謝的影響Fig.3 Effects of different SO2 mass concentration on metabolism of strains

2.2.5 糖度耐受性篩選

菌株對(duì)葡萄糖的耐受性如圖4所示。在葡萄糖質(zhì)量濃度<240 g/L時(shí),原始菌株YK表現(xiàn)出高耐受性，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度>240 g/L時(shí)，原始菌株YK生長(zhǎng)代謝受到明顯抑制，發(fā)酵活力降低；誘變菌株YK-12表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖的不耐受，在不同葡萄糖質(zhì)量濃度下，該菌株生長(zhǎng)代謝緩慢，無(wú)法滿足葡萄酒的發(fā)酵條件；在葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到280 g/L時(shí)，所有菌株均表現(xiàn)出不耐受。果酒酒精發(fā)酵時(shí)初始糖度一般<250 g/L[22]，所以在葡萄糖質(zhì)量濃度<250 g/L時(shí)除誘變菌株YK-12表現(xiàn)出不耐受，其余6株菌株均表現(xiàn)出一定的耐受性。

圖4 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)菌株代謝的影響Fig.4 Effect of different glucose mass concentration on metabolism of strain

2.2.6 酸耐受性篩選

發(fā)酵過(guò)程中，葡萄汁酸度過(guò)高會(huì)直接影響酵母菌的活性，抑制其代謝生長(zhǎng)甚至殺死酵母菌。因此，酵母要有一定的耐酸能力適應(yīng)復(fù)雜的釀酒環(huán)境。不同酸度環(huán)境對(duì)菌株代謝影響如圖5所示。誘變菌株YK-12，YK-28在不同pH環(huán)境下具有較強(qiáng)的耐受性；誘變菌株YK-8對(duì)酸性環(huán)境敏感，在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)代謝緩慢；原始菌株YK，誘變菌株YK-1，YK-8，YK-13，YK-29在pH為2.5的高酸性環(huán)境中受到了嚴(yán)重抑制，隨著pH值的增高菌株生長(zhǎng)代謝速率逐漸增強(qiáng)。葡萄酒在發(fā)酵過(guò)程中pH一般在3.3～3.5，此范圍內(nèi)雜菌會(huì)受到抑制，保證葡萄酒品質(zhì)。因此，原始菌株YK，誘變菌株YK-1，YK-12，YK-13，YK-28，YK-29在此酸度范圍內(nèi)能較好生長(zhǎng)。

圖5 不同pH值對(duì)菌株代謝的影響Fig.5 Effect of different pH on metabolism of strain

綜上所述，結(jié)合菌株耐受性分析，選取誘變菌株YK-1，YK-12，YK-28，YK-29進(jìn)行下一步產(chǎn)香復(fù)篩。

2.3 產(chǎn)香非釀酒酵母復(fù)篩

發(fā)酵衍生的酯類在很大程度上決定了葡萄酒的果味；有機(jī)酸影響發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味與滋味，也是構(gòu)成酵母揮發(fā)性風(fēng)味的重要前體物質(zhì)[23]。采用皂化回流法對(duì)耐受性強(qiáng)的4株誘變菌株進(jìn)行總酯、總酸含量測(cè)定，以原始菌株為對(duì)照，結(jié)果如表3所示。代謝生長(zhǎng)72 h后，誘變菌株YK-29發(fā)酵液中總酯、總酸含量顯著高于其他各組菌株，分別為2.15 g/100mL、0.135%；誘變菌株YK-28產(chǎn)酯能力顯著低于對(duì)照組；誘變菌株YK-12與對(duì)照組產(chǎn)酯能力差異不顯著，分別為0.53、0.44 g/100mL。4株誘變菌株的產(chǎn)酸能力均高于對(duì)照組，產(chǎn)酸能力由高到低依次為YK-29>YK-12>YK-28>YK-1。

表3 菌株總酯、總酸含量Table 3 Total ester and total acid content of the strain

根據(jù)產(chǎn)酯、產(chǎn)酸能力測(cè)試，綜合分析篩選出產(chǎn)香能力最優(yōu)的誘變菌株YK-1、YK-29。

2.4 遺傳穩(wěn)定性測(cè)試

通過(guò)ARTP誘變選育的菌株仍然具有不穩(wěn)定性，會(huì)有回復(fù)性突變和隱性突變的可能，因此對(duì)誘變菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)是驗(yàn)證菌株傳代穩(wěn)定性的有效方法[24]。將誘變菌株YK-1，YK-29連續(xù)傳代5次，測(cè)定產(chǎn)酸產(chǎn)酯能力，結(jié)果如表4所示。誘變菌株YK-1，YK-29產(chǎn)酯能力分別穩(wěn)定在1.55～1.7、2.02～2.21 g/100mL；產(chǎn)酸能力穩(wěn)定在0.051%～0.060%、0.131%～0.141%，各代菌株總酯、總酸含量差異不顯著，變化幅度小。因此，可以證明誘變菌株YK-1，YK-29產(chǎn)酯、產(chǎn)酸能力可以穩(wěn)定遺傳，發(fā)生回復(fù)性突變概率較小，可以應(yīng)用到葡萄酒發(fā)酵中。

表4 菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果Table 4 Genetic stability test results of the strain

2.5 發(fā)酵能力驗(yàn)證

為驗(yàn)證誘變菌株是否有良好的發(fā)酵性能，把誘變菌株接種到總糖含量為225 g/L的葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵周期為8 d，同時(shí)設(shè)原始菌株YK為對(duì)照組。發(fā)酵8 d后菌株產(chǎn)酒精能力如表5所示。誘變菌株YK-1，YK-29產(chǎn)酒精能力顯著高于對(duì)照組,分別為6.45%、7.31%，產(chǎn)酒精能力分別提高149%和169%，可以更長(zhǎng)時(shí)間的參與葡萄酒的前期發(fā)酵，通過(guò)菌株的代謝為葡萄酒提供更多的風(fēng)味物質(zhì)。因此，2株誘變菌株均有良好的發(fā)酵性能。

表5 菌株發(fā)酵能力驗(yàn)證Table 5 Verification of fermentation ability of strain

2.6 產(chǎn)香能力驗(yàn)證

由于非釀酒酵母發(fā)酵能力弱，無(wú)法獨(dú)自完成葡萄酒整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，一般多采用與商業(yè)釀酒酵母混合發(fā)酵方式進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵[9]。因此，選擇將原始菌株YK，誘變菌株YK-1，YK-29與商業(yè)酵母以1∶1接種比例接種到葡萄汁進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。對(duì)3款葡萄酒進(jìn)行定量描述分析，雷達(dá)圖如圖6所示。3款葡萄酒中主要的香氣是花香、水果味、生青味、漿果味、煙熏味、香料味。3款葡萄酒中漿果味、水果味香氣突出，2個(gè)特征香氣強(qiáng)度均高于對(duì)照組；花香強(qiáng)度3款酒基本一致；由于酒齡較輕的緣故，3款葡萄酒均帶有輕微生輕味，隨著酒齡的增長(zhǎng)生青味會(huì)慢慢消失。整體來(lái)看，誘變菌株YK-1，YK-29接種增強(qiáng)了葡萄酒漿果味和水果味，與菌株產(chǎn)酯產(chǎn)酸能力相吻合。

圖6 香氣特征雷達(dá)圖Fig.6 Aroma characteristic radar map

3 結(jié)論

本研究通過(guò)從葡萄皮表面篩選分離的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)YK經(jīng)過(guò)ARTP誘變后，利用TTC產(chǎn)酒精能力試驗(yàn)，杜氏小管產(chǎn)氣試驗(yàn)，耐受性試驗(yàn)和產(chǎn)香試驗(yàn)篩選獲得了2株耐受性高，產(chǎn)香能力強(qiáng)的誘變菌株YK-1和YK-29。將誘變菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，分別接種于葡萄汁中，誘變菌株產(chǎn)酯產(chǎn)酸能力穩(wěn)定，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。與出發(fā)菌株YK相比，誘變菌株YK-1，YK-29釀造的葡萄酒產(chǎn)酒精能力分別提高了149%和169%。通過(guò)定量描述分析，誘變菌株參與發(fā)酵的葡萄酒具有花香、水果味、生青味、漿果味、煙熏味、香料味，其中水果味和漿果香味強(qiáng)度均高于對(duì)照組。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中誘變菌株的參與可以提高葡萄酒的香氣質(zhì)量，與本次試驗(yàn)?zāi)康南喾?/p>

目前，對(duì)于非釀酒酵母的研究多數(shù)集中在其與釀酒酵母共發(fā)酵體系中菌種之間的相互作用，以及通過(guò)改變2種酵母菌的接種方式，接種比例探究混合發(fā)酵體系最佳發(fā)酵工藝條件來(lái)提高葡萄酒品質(zhì)等方面，對(duì)于非釀酒酵母本身研究較少。本研究以非釀酒酵母本身存在的問(wèn)題為切入點(diǎn)，對(duì)新疆本土非釀酒酵母進(jìn)行ARTP誘變，經(jīng)過(guò)多輪篩選最終得到能穩(wěn)定遺傳的目標(biāo)菌株。誘變菌株YK-1，YK-29在葡萄酒中的應(yīng)用有望改變葡萄酒品質(zhì)單一化的局面，在葡萄酒釀造生產(chǎn)方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。