海藻糖復(fù)配蔗糖和山梨醇對(duì)未漂洗大黃魚魚糜的抗凍效果研究

熊澤語，謝晨，陳百科，李慧，金素萊曼，包海蓉,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

魚糜制品作為現(xiàn)今深受人群青睞的食品，營養(yǎng)豐富，味美價(jià)廉，種類繁多，還可長期保存，適合全年齡段消費(fèi)者食用。當(dāng)下常見的魚糜類產(chǎn)品是先通過將生魚采肉、斬拌、鹽擂后形成初始魚糜凝膠，再經(jīng)過各自加工方式形成不同種類的魚糜制品。在傳統(tǒng)魚糜生產(chǎn)工藝中，漂洗是不可缺少的工序之一。但漂洗同時(shí)也會(huì)使蛋白、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)流失，造成產(chǎn)品得率的下降，漂洗廢水排放也會(huì)造成環(huán)境的污染。因此，制作未漂洗魚糜不僅可省略漂洗工序，還能減少廢水對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)減少魚糜營養(yǎng)成分損失，提髙魚糜得率。

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)作為常見魚類，因其鮮美的味道與細(xì)致的口感而廣受消費(fèi)者的喜愛，其肉營養(yǎng)價(jià)值高，可為消費(fèi)者提供充足的蛋白質(zhì)與不飽和脂肪酸[1]。為了有效貯存魚糜及其制品，通常以冷凍保藏作為其貯存方式，延長貨架期。但是，內(nèi)源性蛋白酶的作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，鍵位暴露，使得魚糜內(nèi)部肌原纖維蛋白易發(fā)生冷凍變性，加上未漂洗魚糜內(nèi)部含有更多的脂肪、水溶性蛋白等，使得脂肪氧化加速，其產(chǎn)生的醛、酮類物質(zhì)則會(huì)與蛋白交聯(lián)進(jìn)而加重蛋白質(zhì)的變性。并且間接的影響魚糜的保水性、凝膠特性[2]。

為解決蛋白質(zhì)冷凍變性，國內(nèi)魚糜在冷凍保藏上常采用復(fù)合磷酸鹽以及4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)蔗糖+4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)山梨醇混合而成的商業(yè)抗凍劑來延緩蛋白變性，但諸多國家對(duì)于復(fù)合磷酸鹽的使用較為嚴(yán)格，并且過度的添加亦會(huì)影響人體對(duì)鈣離子的吸收；另一方面，商業(yè)抗凍劑的高熱量與高甜度也破壞了食材的口感、降低消費(fèi)者的購買欲望[3]。因此，國內(nèi)外探究以動(dòng)植物的天然提取物作為抗凍劑，延緩魚糜冷凍過程中品質(zhì)的下降，高文宏等[4]研究了水溶性大豆多糖對(duì)冷凍魚糜蛋白變性起抑制作用；HUANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)菊粉可以增強(qiáng)MTGase對(duì)肌球蛋白重鏈的交聯(lián)作用，從而抑制冷凍過程中蛋白質(zhì)氧化降解。

常用的天然抗凍劑有海藻糖、海藻膠、茶多酚、酵母提取物等[6]，而海藻糖類可以有效地促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化自由基的清除，延緩蛋白質(zhì)、脂肪等氧化變性，并且可以提升肌原纖維蛋白溶解度[7]，其也常因低熱量、低甜度等優(yōu)點(diǎn)作為代糖用于食品生產(chǎn)中。未漂洗魚糜在冷凍過程中更易發(fā)生蛋白質(zhì)變性，本研究將海藻糖、蔗糖、山梨醇以不同比例復(fù)配加入并與常規(guī)商業(yè)抗凍劑(4%蔗糖+4%山梨醇)對(duì)比，以期探究復(fù)配多糖對(duì)于大黃魚未漂洗魚糜Ca2+-ATPase活性、總巰基含量、pH、凝膠強(qiáng)度、持水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量以及凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化，以期探究一種新型復(fù)配抗凍劑最佳比例，旨在將天然抗凍劑與商業(yè)抗凍劑相結(jié)合，降低其熱量與甜度，并在此基礎(chǔ)上提高其抗凍性能，延緩未漂洗魚糜品質(zhì)的降低。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰鮮大黃魚：通框養(yǎng)殖，規(guī)格1 kg/尾，寧德蔡氏水產(chǎn)有限公司，連夜捕撈，次日冰臺(tái)送達(dá)使用。

氯化鈉、氯化鉀、馬來酸、Tris固體、酒石酸鉀鈉、濃硫酸、ATP、5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、硼酸、曲拉通(Tritonx-100)、鉬酸銨、牛血清白蛋白、硫酸亞鐵、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液、溴化鉀、無水硫酸銅等(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PBS磷酸緩沖液、2.5%戊二醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

D-130電動(dòng)勻漿機(jī)，德國Wiggens有限公司；GL-20B 高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司；切碎機(jī)QSJ-B02R1，九陽電器有限公司；UV1100型紫外分光光度計(jì)，廣州罡然機(jī)電設(shè)備有限公司；FI-TR傅里葉紅外分光光度計(jì)，賽默飛世爾；日立SU5000熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日立(中國)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚糜樣品的制備

未漂洗魚糜制備：將大黃魚隨機(jī)分成5組，分別去頭、去尾、去皮、去鱗、去內(nèi)臟；清洗,取肉于吸水紙上瀝干表面水分；取300 g碎魚肉于絞肉機(jī)中攪碎,以不添加抗凍劑作為空白對(duì)照組(CK)，保持總糖量8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)不變?？紤]到海藻糖(trehalose, TR)的經(jīng)濟(jì)效益，以及預(yù)實(shí)驗(yàn)中得出單獨(dú)加入4%、6%、8%的TR并無太大差異，因此分別加入商業(yè)抗凍劑4%山梨醇(sorbitol，SUC)+4%蔗糖(sucrose，SBT)、2%TR+3%SUC+3%SBT、3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT、4%TR+2%SUC+2%SBT、斬拌3 min制成魚糜。-60 ℃冰箱內(nèi)快速冷凍2.5 h，轉(zhuǎn)入-18 ℃冰箱冷凍保藏0、15、30、45、60、75、90 d，隨機(jī)抽樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 肌原纖維蛋白的制備

參照KATOH等[8]的方法提取肌原纖維蛋白，整個(gè)過程利用冰浴將溫度維持在5 ℃以下。魚糜解凍后稱取樣品5 g，先加入提取緩沖液A、B各20 mL(其中，緩沖液A：40 mmol/L Tris-馬來酸，0.16 mol/L KCl，1%Triton，馬來酸調(diào)pH 至7.5；緩沖液B：40 mmol/L Tris-馬來酸，0.16 mol/L KCl，馬來酸調(diào)pH至 7.5)，10 000 r/min均質(zhì)2 min，5 000 r/min，4 ℃離心10 min，取沉淀加入40 mL 緩沖液B，重復(fù)上述步驟2次得粗蛋白；接著將粗蛋白充分溶于20 mL 0.1 mol/L KCl，同之前步驟均質(zhì)，離心。最后沉淀溶于40 mL 0.1 mol/L KCl重復(fù)上述操作，將蛋白溶液用雙層紗布過濾雜質(zhì)后離心，沉淀即為肌原纖維蛋白。蛋白濃度以雙縮脲法處理并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，最后以0.6 mol/L KCl配制成所需濃度，置于4 ℃冰箱貯存待用。

1.2.3 Ca2+-ATPase活性測(cè)定

參考BENJAKUL等[9]的方法，量取3.5 mL 2 mg/mL蛋白質(zhì)溶液加入0.3 mL 0.5 mol/L Tris-Maleat(pH 7.0)和0.5 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液，再加入0.25 mL 20 mmol/L ATP，25 ℃水浴10 min后加入2.5 mL (體積分?jǐn)?shù)) TCA，5 000 r/min，4 ℃，離心5 min。取上清液0.5 mL加入蒸餾水2.5 mL，振蕩搖勻后加入2 mL硫酸亞鐵-鉬酸銨溶液(取10 mL 10%鉬酸銨硫酸溶液加5 g硫酸亞鐵定容到100 mL)，25 ℃靜置1 min，在660 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果以1 mg肌原纖維蛋白1 min生成無機(jī)磷量(μmol)來表示。其中空白組中ATP和TCA調(diào)換添加順序。

1.2.4 魚糜總巰基含量測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法，取1 mL 2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液加入 50 mmol/L的磷酸緩沖液9 mL，混勻后取4 mL混合液加入0.4 mL的Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)，40 ℃水浴25 min，然后412 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.5 魚糜pH的測(cè)定

測(cè)定方法依照 GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》[11]稍作修改(將10 g樣品降至5 g，100 mL蒸餾水減少至50 mL)，將5 g魚糜樣品充分溶于50 mL蒸餾水中，12 000 r/min均質(zhì)60 s后與4 ℃恒溫箱中靜置30 min，離心。上清液于濾紙上再次過濾，用pH計(jì)測(cè)定pH值，每組3個(gè)平行。

1.2.6 魚糜凝膠的制備

將-18 ℃冷凍魚糜取出放入3 ℃低溫培養(yǎng)箱中放置到中心溫度為-5 ℃左右的半解凍狀態(tài)，切成小塊，放入攪碎機(jī)中空攪2 min，后加入25 g/L食鹽混勻攪拌3 min，最后加冰水調(diào)節(jié)水分含量至80%后，將肉漿注入小型灌腸模具中，灌入直徑3.5 cm的塑料腸衣中封口，采用二段式加熱(40 ℃加熱60 min，90 ℃加熱30 min)，后將魚腸放入碎冰中冷卻30 min，放入4 ℃冰箱中保藏，統(tǒng)一在4 d內(nèi)陸續(xù)完成凝膠指標(biāo)測(cè)定。過程中，攪拌機(jī)放入碎冰中，全程保持?jǐn)嚢铚囟鹊陀? ℃。

1.2.7 魚糜凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]的方法稍作修改。冰箱中取出魚腸室溫放置0.5 h，將魚腸切成直徑3 cm，高3 cm的圓柱體，每組5個(gè)平行。測(cè)試條件：選用P/5S探頭。測(cè)試參數(shù)：測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速度均為1 mm/s，形變壓縮比50%，觸發(fā)力5.0 g。記錄破斷強(qiáng)度(g)和破斷距離(cm)，凝膠強(qiáng)度計(jì)算如公式(1)所示：

凝膠強(qiáng)度/(g·mm)=破斷強(qiáng)度×破斷距離

(1)

1.2.8 魚糜凝膠持水性測(cè)定

持水性(water holding capactity,WHC)測(cè)定：參考文獻(xiàn)[13]方法，將制備好的魚糜凝膠切成0.5 cm左右的薄片，稱重(m1)后用雙層濾紙包裹，離心機(jī)離心(4 ℃，3 000×g，10 min)，隨后濾紙中取出樣品稱重(m2)，持水性計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.2.9 魚糜肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法，使用傅里葉變換紅外光譜測(cè)定未漂洗魚糜肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的變化，先將肌原纖維蛋白冷凍干燥去除水分。取5 mg 凍干樣品和100 mg 溴化鉀粉末充分混合后充分研磨，使用壓片機(jī)將粉末壓縮成薄片。保持全程干燥條件下，室溫環(huán)境中以光譜分辨率為4 cm-1進(jìn)行測(cè)試，掃描32次，波數(shù)范圍為 4 000～400 cm-1。使用 PeakFit 4.12對(duì)獲得的圖上的曲線進(jìn)行多次曲線擬合，然后以二階導(dǎo)數(shù)求出峰面積所占比。

1.2.10 魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)

參考PETCHARAT等[15]的方法略作修改。將魚糜凝膠切為厚度不超過3 mm的片狀，并用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液于4 ℃培養(yǎng)箱中固定24 h，去除固定液，使用磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.2)漂洗3次，15 min/次，后用蒸餾水反復(fù)沖洗，而后依次用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液梯度脫水，每次15 min，最后以100%乙醇溶液脫水2次，每次30 min，進(jìn)行冷凍干燥，而后噴金，掃描電鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Microsoft Excel軟件作圖，并用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05，不顯著水平為P>0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+-ATPase活性測(cè)定

Ca2+-ATPase活性常用來評(píng)判蛋白質(zhì)的冷凍變性程度。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+-ATPase活性下降可能是肌球蛋白中的活性巰基氧化成二硫鍵，蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使得肌球蛋白頭部與ATP的接觸減少導(dǎo)致[16]。由圖1可知，凍藏時(shí)間為90 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組Ca2+-ATPase活性顯著下降(P<0.05)，下降率分別為67.36%、53.13%、57.17%、54.43%、47.58%，與不添加組(CK)相對(duì)比，添加組均可一定程度上抑制Ca2+-ATPase活性下降。隨著TR含量的增加，對(duì)Ca2+-ATPase活性下降的抑制明顯，當(dāng)TR含量達(dá)到4%時(shí)，Ca2+-ATPase活性最高(P<0.05)，這可能是因?yàn)?，相比于商業(yè)抗凍劑，TR內(nèi)部有更多的羥基可以與水分子相互作用，從而減少冷凍期間冰晶的生長，避免其破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，防止蛋白變性。

圖1 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚魚糜Ca2+-ATPase 活性的影響Fig.1 Effect of compound antifreeze on Ca2+-ATPase activity of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi 注：不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)(下同)

2.2 巰基含量的測(cè)定

總巰基作為反應(yīng)蛋白質(zhì)氧化程度的一大指標(biāo)，是活性巰基與非活性巰基含量的總和[17]。巰基在肌原纖維蛋白中是活性極強(qiáng)的基團(tuán)，蛋白質(zhì)冷凍變性時(shí)，其被氧化形成二硫鍵，而隨著外層蛋白質(zhì)的變性引起的結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)部蛋白質(zhì)的非活性巰基暴露出來，繼續(xù)被氧化，進(jìn)一步導(dǎo)致巰基含量下降[18]。二硫鍵含量的增加又會(huì)進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)其他特性的變化。如圖2所示，0～30 d蛋白質(zhì)巰基含量下降劇烈，而后巰基含量下降趨于平緩，這可能是因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)冷凍變性，導(dǎo)致巰基含量下降，而隨著外部蛋白不斷變性，肽鏈打開，導(dǎo)致內(nèi)部蛋白質(zhì)巰基暴露出來，而使總巰基含量的增加，造成后期總巰基含量的下降越發(fā)平緩。凍藏90 d后，各實(shí)驗(yàn)組巰基含量顯著下降(P<0.05)；與0 d相比分別下降了37.89%、27.30%、30.47%、27.11%、24.03%，并且4%TR+2%SUC+2%SBT的巰基含量顯著高于其他4組(P<0.05)，這與Ca2+-ATPase 活性相對(duì)應(yīng)，說明總巰基含量的下降可以影響Ca2+-ATPase 活性的變化[19]?？梢?，添加復(fù)配多糖可以在不同程度上延緩巰基含量的下降，而隨著海藻糖占總百分比的升高，這種延緩效果越發(fā)顯著。

圖2 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚魚糜巰基含量的影響Fig.2 The effect of compound antifreeze on the sulfhydryl content of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

2.3 pH值的測(cè)定

pH是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品變質(zhì)與否的重要指標(biāo)，而魚糜凍藏期間pH值變化與凍藏前添加抗凍劑與否有著密切聯(lián)系。由圖3可知，整個(gè)凍藏期間，各組pH下降幅度并不大，均呈現(xiàn)出前30 d先下降，而后緩慢回升或趨于平衡的趨勢(shì)；這是因?yàn)閮霾厍捌隰~糜內(nèi)部乳糖等降解產(chǎn)生乳酸，并且ATP分解產(chǎn)生磷酸使得pH先出現(xiàn)下降趨勢(shì)[20]。而到了凍藏后期，隨著蛋白質(zhì)冷凍變性而生成小分子氨基酸進(jìn)一步分解產(chǎn)生胺類等揮發(fā)性物質(zhì)，造成pH轉(zhuǎn)而上升或趨于平緩，這與謝青青等[21]研究的魚糜制品凍融循環(huán)期間pH的變化趨勢(shì)相似。

其中空白組與2%TR+3%SUC+3%SBT在0～90 d時(shí)pH下降相對(duì)較大，從0 d的6.92下降到 6.77 與6.79而其他各處理組則分別為6.81、6.83、6.85，較小程度上延緩了pH值下降(P<0.05)，這是由于小分子糖的加入產(chǎn)生的抗凍效果，避免了大量的冰晶在胞內(nèi)生成而產(chǎn)生的細(xì)胞液濃縮、胞內(nèi)濃度升高，進(jìn)而導(dǎo)致pH的下降。特別是復(fù)配抗凍劑比例為4%TR+2%SUC+2%SBT時(shí)，pH下降的趨勢(shì)更為緩慢，90 d時(shí)下降程度最小，為7.24%，說明其對(duì)于冰晶生成的抑制效果最好。

2.4 魚糜凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

凝膠強(qiáng)度表示凝膠破斷力和凹陷距離的乘積，可以反映凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)是否牢固；而凝膠強(qiáng)度的變化則可以反過來說明魚糜凝膠內(nèi)部的肌原纖維蛋白品質(zhì)變化[22]。如圖4所示，隨著凍藏時(shí)間的增加，魚糜凝膠強(qiáng)度總體呈不斷下降趨勢(shì)，空白組凝膠強(qiáng)度從開始的652.60 g·mm下降到90 d的157.35 g·mm，下降幅度最大，達(dá)到75.92%；而4%TR+2%SUC+2%SBT組從開始的627.72 g·mm下降到90 d的 426.38 g·mm，下降程度最小，為30.07%，明顯優(yōu)于其他各組(P<0.05)，研究表示小分子多糖對(duì)冷凍過程中的冰晶產(chǎn)生、聚集起抑制作用，因此可以減少冰晶對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的損壞，從而延緩魚糜凝膠強(qiáng)度的下降，而4%TR+2%SUC+2%SBT、蔗糖組合對(duì)蛋白質(zhì)冷凍保護(hù)作用最好，這與蘇趙等[23]研究的海藻糖對(duì)草魚魚糜冷凍期間延緩凝膠強(qiáng)度下降的結(jié)果相類似。

圖3 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚魚糜pH值的影響Fig.3 Effect of compound antifreeze on the pH value of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

圖4 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚魚糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig.4 The effect of compound antifreeze on the gel strength of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

2.5 魚糜凝膠持水性的測(cè)定

持水性是評(píng)價(jià)魚糜品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，表示凝膠遭受外力時(shí)維持水分的能力。其直接反映了凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)結(jié)合水能力的強(qiáng)弱，凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜、緊致，說明蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合能力強(qiáng)，表現(xiàn)出來的持水性也較好；反之則說明凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散，持水性較差[24]。如圖5所示，凍藏期間，空白組持水力急劇下降(P<0.05)；與空白組相比，添加組持水力則下降的較為緩慢。在90 d時(shí)空白組持水性以及顯著低于其他4組(P<0.05)，較新鮮魚糜下降了2.64%，添加物4組持水力相比于新鮮魚糜分別下降了1.40%、1.61%、1.43%、1.39%，差異較小(P>0.05)；說明加入不同比例的復(fù)配抗凍劑均能作用于蛋白質(zhì)，通過多糖與水分的結(jié)合從而減少因細(xì)胞在冷凍過程中而導(dǎo)致水分的流失。

圖5 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚魚糜持水性的影響Fig.5 Effect of compound antifreeze on water holding capacity of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

2.6 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

蛋白質(zhì)是通過小分子氨基酸形成的多條肽鏈再經(jīng)過不同方式的組合所構(gòu)成，而二級(jí)結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)最基本的空間構(gòu)象，是判斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與否的重要指標(biāo)[25]。氫鍵是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的主要作用力，大部分蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)通過氫鍵使氨基酸肽鏈上的羰基與酰胺基團(tuán)鏈接而成，分別形成4種不同構(gòu)象：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲。其代表的波長區(qū)域分別為：β-折疊1 600～1 640 cm-1、無規(guī)則卷曲1 640～1 650 cm-1、α-螺旋1 650～1 660 cm-1、β-轉(zhuǎn)角1 660～1 700 cm-1。而傅里葉-紅外變換光譜可以測(cè)定蛋白質(zhì)不同波長下的基團(tuán)、構(gòu)象的來觀察凍藏過程中蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，其中酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的主要范圍[26]。圖6為新鮮魚糜與90 d凍藏后各組二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比含量的變化。由圖6可知，新鮮未漂洗魚糜的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲含量分別是25.12%、34.61%、26.08%、14.19%，經(jīng)過冷凍保藏后，各組α-螺旋含量均有所降低，分別下降了39.41%、11.50%、10.35%、8.76%、4.66%，說明了肌球蛋白展開，疏水基團(tuán)暴露。而無規(guī)則卷曲含量則顯著上升，進(jìn)一步說明了蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)的不斷展開、無序結(jié)構(gòu)進(jìn)而增加；從而導(dǎo)致魚糜形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)變得不規(guī)則，這也符合凝膠強(qiáng)度隨凍藏時(shí)間延長而降低的趨勢(shì)。5組實(shí)驗(yàn)組中，添加4%TR+2%SUC+2%SBT的抗凍劑時(shí)與新鮮魚糜的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量最為相近，且效果好于商業(yè)抗凍劑，說明次比例可以更好穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的完整。

圖6 冷凍未漂洗大黃魚魚糜二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Fig.6 Changes in the secondary structure of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

2.7 魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

使用掃描電子顯微鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)，是判斷蛋白質(zhì)變性程度的常用方法。如圖7所示，新鮮魚糜凝膠結(jié)構(gòu)飽滿，凝膠網(wǎng)絡(luò)致密有序，形成了層次鮮明的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

A-空白對(duì)照組(新鮮)；B-空白對(duì)照組(90 d)；C-商業(yè)抗凍劑； D-2%TR+3%SUC+3%SBT；E-3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT； F-4%TR+2%SUC+2%SBT圖7 冷凍未漂洗大黃魚魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的變化Fig.7 Changes in gel structure of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

經(jīng)過90 d的凍藏，各組蛋白凝膠均出現(xiàn)不同程度的變化，空白對(duì)照組在90 d時(shí)凝膠結(jié)構(gòu)變化較為明顯，凝膠孔洞增多、變大，表面粗糙并且突起顯著減少，說明凝膠網(wǎng)絡(luò)三維結(jié)構(gòu)受到較大破壞(圖7-B)。而添加抗凍劑的4組凝膠也都有不同程度的破損，但相比于空白對(duì)照組明顯變化較小。商業(yè)抗凍劑組相較于空白組表面突起較多，蛋白纖維平滑，孔洞較大(圖7-C)；而 2%TR+3%SUC+3%SBT組相對(duì)于新鮮魚糜突起減少，凝膠結(jié)構(gòu)較為干癟組，出現(xiàn)較多的孔洞(圖7-D)。而3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT與4%TR+2%SUC+2%SBT組的凝膠網(wǎng)絡(luò)相比于2%TR+3%SUC+3%SBT組結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜、緊致，結(jié)構(gòu)也更具有空間立體感，產(chǎn)生的孔洞也明顯減少，與商業(yè)抗凍劑組較為相近(圖7-E、圖7-F)。由此說明海藻糖含量的增加可以減小凝膠網(wǎng)絡(luò)在凍藏過程中的變化，并且對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用較好。

3 結(jié)論

魚糜在冷凍保藏過程中，蛋白質(zhì)的冷凍變性會(huì)對(duì)魚糜品質(zhì)、口感等特性產(chǎn)生較大損害；其直接造成肌原纖維蛋白含量的下降，這主要是由于肌球蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，從而對(duì)魚糜表觀上的特性，如凝膠強(qiáng)度、持水性等產(chǎn)生影響。此外，魚糜凍藏過程中產(chǎn)生的冰晶也會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)魚糜凝膠產(chǎn)生機(jī)械性的損害。

由此本試驗(yàn)研究了加入不同比例的海藻糖、山梨醇、蔗糖(保持總添加量與商業(yè)抗凍劑一致)對(duì)冷凍未漂洗大黃魚魚糜Ca2+-ATPase活性，總巰基含量、pH值、凝膠強(qiáng)度、凝膠持水性、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT、4%TR+2%SUC+2%SBT作為抗凍劑加入均可以在一定程度上抑制蛋白質(zhì)的冷凍變性，并間接延緩魚糜凝膠的劣化，而當(dāng)添加量為4%海藻糖+2%山梨醇+2%蔗糖時(shí)，對(duì)于蛋白質(zhì)各指標(biāo)的改善最為顯著。與商業(yè)抗凍劑相比具有更小的熱量與甜度，也能滿足廣大消費(fèi)者的要求，是商業(yè)抗凍劑的良好替代品，也為今后未漂洗魚糜冷凍保藏研究提供數(shù)據(jù)支持。