植物乳桿菌發酵豆乳對多囊卵巢綜合征大鼠的影響

石劉婷，賀禹豐，楊羽倩，祁亞勁，魯佳欣，詹語，郭敏，王慧玲，趙建新，張灝，王剛*，陳衛

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(蘇州市立醫院 南京醫科大學附屬蘇州醫院，南京醫科大學姑蘇學院，江蘇 蘇州，215002)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見的內分泌疾病，發病率高達5%～10%[1]。PCOS患者的主要臨床表現為不孕、月經不調、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變等[2-3]。此外，PCOS患者的代謝功能異常，包括胰島素抵抗和脂質代謝異常等[4]。研究表明，PCOS患者患二型糖尿病、心血管疾病、子宮內膜癌等疾病的風險也會顯著增加[5]。目前，藥物治療依然是緩解PCOS癥狀的首選方案，常用的藥物包括口服避孕藥、促排卵藥物、胰島素增敏劑等。這些藥物主要是通過調節月經周期、降低胰島素抵抗來調節激素水平，促發排卵。但是使用以上藥物也存在著明顯的副作用，如口服避孕藥可能增加胰島素抵抗的風險，胰島素增敏劑可能增加患膀胱癌的風險等[6-7]。因此，尋找一種更加安全且有效的PCOS緩解手段很有必要。

相關研究表明，PCOS患者往往伴隨著腸道菌群的失調，其特征表現為菌群α多樣性降低以及特定種屬豐度的顯著變化[8-10]。此外，研究表明，將正常大鼠的腸道菌群移植到PCOS大鼠中，PCOS大鼠的癥狀得到了緩解，而將PCOS小鼠的腸道菌群移植到正常小鼠體內，正常小鼠也會表現出一定的PCOS癥狀[1, 11]。因此，腸道菌群與PCOS二者之間存在十分密切的聯系，以腸道菌群為靶點的膳食干預方法具有緩解PCOS癥狀的潛在價值。益生菌是一類能夠對宿主健康發揮有益作用的活性微生物，可以調節宿主的腸道菌群。研究表明，長期服用益生菌可以調節PCOS患者血清中異常的睪酮水平[12]。此外，SHAMASBI等[13]發現長期攝入益生菌可以顯著降低PCOS 患者體內激素和炎癥指標的水平。而本研究團隊也已證明特定植物乳桿菌可以緩解PCOS大鼠的相關病癥[14]。

為了進一步探究具有緩解PCOS潛力的菌株在食品中的應用價值，本研究將3株植物乳桿菌(CCFM1019、LP4、LP5)進行豆乳發酵，進一步評價了不同植物乳桿菌發酵豆乳攝入對PCOS大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與動物

植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5均來源于江南大學生物技術中心菌種保藏庫，具體信息如表1所示。

表1 實驗菌株的具體信息Table 1 The information of strains used in study

實驗選用購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司的36只SPF級7周齡的雌性SD大鼠，飼養于江南大學動物實驗中心。動物實驗方案經江南大學實驗倫理委員會批準，審批號：JN.No20201030S0421230[283]，所有動物實驗操作符合江南大學動物管理與使用委員會的規定(SYXK 2012—0002)和歐盟指導手冊(編號:2010 /63 /EU)。

1.2 藥品與試劑

大豆、蔗糖購于當地超市；來曲唑片(批號：200903KB，來曲唑單片的有效藥物含量為2.5 mg)，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)，上海麥克林生化科技有限公司；達英-35(批號：KT04L5J2，達英-35單片的有效藥物含量為醋酸環丙孕酮2 mg和炔雌醇0.035 mg)，拜爾醫藥保健有限公司；大鼠性激素睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、孕酮(progesterone，P)、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)ELISA試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

PB300-N電子天平，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；BS-480全自動生化分析儀，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；GRP-9160型隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；Eppendorf 高速冷凍離心機5804R，德國艾本德股份公司；994型Thermo超低溫冰箱、酶標儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；血糖儀，Roche Diabetes Care GmbH羅氏血糖健康醫護公司。

1.4 發酵豆乳的制備

挑選表面光澤無霉爛變質的大豆，按大豆∶純凈水=1∶10(g∶mL)加水過夜浸泡。將浸泡過的大豆用破壁機磨漿，磨漿過濾之后沸水煮漿，添加7%蔗糖調漿，在115 ℃下滅菌20 min，冷卻至室溫。按照4%的接種量將3株植物乳桿菌分別接種至已經冷卻好的豆乳中，發酵溫度為37 ℃，發酵時間為8 h，最終發酵終點發酵豆乳活菌數均在1×108CFU/mL，-80 ℃貯存，待用。

1.5 動物實驗方案

大鼠適應喂養1周后，將36只SD雌性大鼠按體重隨機分為空白組、模型組、達英-35組、CCFM1019組、LP4組、LP5組，每組6只。造模期間，模型組、達英-35組和發酵豆乳干預組大鼠分別每天灌胃來曲唑懸濁液(20片來曲唑懸浮于250 mL 1% CMC溶液)，最終灌胃體積達到0.5 mL/100g BW，連續灌胃21 d誘導建立PCOS模型[15]，同時空白組大鼠每天灌胃1%CMC溶液，最終灌胃體積達到0.5 mL/100g BW。干預期、空白組、模型組分別灌胃2 mL未發酵豆乳，達英-35組每天灌胃達英-35懸濁液(1片達英-35懸浮于50 mL 1% CMC溶液)，最終灌胃體積達到0.45 mL/100g BW，乳酸菌發酵豆乳組分別灌胃2 mL發酵豆乳，具體實驗流程如圖1所示。實驗期間，觀察各組大鼠一般情況，記錄體重變化。

圖1 動物實驗流程圖Fig.1 The process of animal experiment

1.6 口服葡萄糖耐量實驗

灌胃3周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，利用血糖儀測空腹血糖值，按0.5 mL/100g體重灌胃50%葡萄糖注射液，鼠尾采血測量灌胃后30、60、90、120 min血糖值。

1.7 血清及組織收集

實驗第29天采用異氟烷麻醉法，使大鼠麻醉，心臟采血，室溫靜置2 h后以3 000 r/min離心15 min收集血清并保存于-80 ℃冰箱。摘取雙側卵巢，用鑷子仔細分離并去除其表面脂肪組織，用天平稱重。一部分卵巢于4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分于液氮中迅速冷凍后轉移至-80 ℃冰箱保存備用。

1.8 大鼠卵巢病理學檢測

將固定在4%多聚甲醛中的卵巢，各級酒精依次脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋，卵巢切片(每張切片厚5 μmol/L)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后鏡檢，盲法統計每張樣本切片的囊性卵泡數、黃體數。

1.9 大鼠血清性激素水平測定

采用ELISA試劑盒檢測血清中的FSH、LH、E2、T水平、P、GnRH，具體操作嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

1.10 大鼠生化分析指標測定

生化分析指標包括谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，總膽固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)，均采用全自動生化分析儀測定。

1.11 數據分析

數據以“均數±標準差”表示，用 GraphPad Prism 5(GraphPad software，California，USA，5.0 版)將實驗數據進行正態分布檢驗，對符合正態分布的數據進行單因素方差分析(Fisher’s LSD檢驗)，對不符合正態分布的數據進行非參數檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)，P<0.05為差異有統計學意義。*為與模型組比較，P<0.05；#為與空白組相比，P<0.05。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠體重以及卵巢重量的影響

由表2和圖2可知，與空白組相比，模型組、達英-35組及發酵豆乳組的大鼠最終體重增加并且體重增量也顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，達英-35組和LP5組大鼠體重增量顯著下降(P<0.05)。以上數據表明植物乳桿菌LP5發酵豆乳具有降低PCOS大鼠體重增加的潛在作用。

如表2所示，與空白組相比，模型組、達英-35組以及發酵豆乳組大鼠卵巢質量均有所增加。這些結果表明植物乳桿菌發酵豆乳在減輕PCOS大鼠卵巢質量上幾乎沒有效果。

表2 各組大鼠體重以及卵巢質量變化Table 2 Changes of body weight and ovarian weight of rats in each group

2.2 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠糖耐量的影響

由圖3-a可知，在給大鼠灌胃60 min后，空白組、模型組、達英-35組及發酵豆乳組血糖均迅速升高。圖3-b中，與空白組相比，模型組糖耐量曲線下面積有增加趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。植物乳桿菌發酵豆乳干預后，LP4組大鼠的糖耐量曲線下面積有減小趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。因此，植物乳桿菌發酵豆乳在調控PCOS大鼠糖耐量上無明顯效果。

a-PCOS大鼠口服葡萄糖耐量測試；b-OGTT曲線下面積圖3 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠糖耐量的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum fermented soymilk on glucose tolerance of PCOS rats 注：*與模型組比較，P<0.05；#與空白組比較，P<0.05(下同)

2.3 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠卵巢病理形態學的影響

由圖4-a可知，空白組大鼠卵巢表面色澤紅潤，可見黃體，無囊性卵泡，而模型組大鼠卵巢表面色澤變淺，黃體數減少，囊性卵泡數增加(圖4-b)。由表3可知，CCFM1019組黃體數目有所增加，囊性卵泡數也有所減少，但差異無統計學意義(P>0.05)；而LP4、LP5組卵巢中的黃體數并未有所增加，但囊性卵泡數有所減少，但差異無統計學意義(P>0.05)。綜上所述，CCFM1019發酵豆乳一定程度上可以減輕來曲唑引起的大鼠卵巢病變。

a-空白組；b-模型組；c-達英-35組；d-CCFM1019組； e-LP4組；f-LP5組圖4 發酵豆乳對PCOS大鼠卵巢病理形態的影響(×40)Fig.4 Effects of L.plantarum fermented soymilk on histopathology of the ovary in PCOS rats 注：標尺為600 μm

2.4 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠血清性激素水平的影響

由圖5-a、圖5-b及圖5-d、圖5-e可知，與空白組相比，模型組大鼠血清中T、LH及FSH的水平顯著升高、P的水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，LP4組大鼠血清中LH水平顯著降低(P<0.05)，CCFM1019組大鼠血清中E2水平顯著提高(P<0.05)。此外，達英-35以及3組植物乳桿菌發酵豆乳均可以顯著降低PCOS大鼠血清中T的水平(P<0.05)，其中，LP4效果最好，達英-35以及LP5次之，CCFM1019效果略差。而由圖5-f可知，各組大鼠血清中GnRH水平差異均無統計學意義(P>0.05)。這些結果表明CCFM1019發酵豆乳在調節PCOS大鼠血清中E2水平上優勢，而LP4發酵豆乳更傾向于在調節T、LH水平上發揮作用。

表3 各組大鼠的黃體數及囊性卵泡數 單位：個

a-血清T水平；b-血清LH水平；c-血清E2水平；d-血清FSH水平；e-血清P水平；f-血清GnRH水平圖5 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠血清性激素水平的影響Fig.5 Effects of L.plantarum fermented soymilk on serum sex hormone levels in PCOS rats

2.5 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠生化分析指標的影響

對PCOS大鼠生化分析指標進行分析，如表4所示，與空白組相比，PCOS大鼠血清中AST含量顯著上升(P<0.05)。與模型組相比，CCFM1019組大鼠血清中的AST含量顯著降低(P<0.05)。此外，植物乳桿菌LP4、LP5發酵豆乳干預后，顯著降低了大鼠血清中ALT及AST含量(P<0.05)。與空白組相比，模型組大鼠血清中LDL-C含量顯著增加(P<0.05)，HDL-C含量顯著下降(P<0.05)。植物乳桿菌發酵豆乳干預后在一定程度上降低大鼠血清中TG、TC及LDL-C含量，其中，LP5顯著降低TC及LDL-C含量(P<0.05)。此外，除了CCFM1019組，其余組別大鼠血清中HDL-C含量進一步降低。因此，植物乳桿菌發酵豆乳對提高PCOS大鼠血清中HDL-C含量無明顯效果。這些結果表明CCFM1019發酵豆乳在調節PCOS大鼠血清中的AST水平上有優勢，而LP4發酵豆乳在調節ALT、AST、TC水平上有優勢，此外，LP5發酵豆乳更傾向于在調節ALT、AST、TC、LDL-C水平上發揮作用。

表4 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠生化指標的影響Table 4 Effects of L.plantarum fermented soymilk on biochemical indexes of PCOS rats

3 結論與討論

臨床上，血清T、LH常作為PCOS患者的一項敏感性指標。研究表明[16]，乳酸雙歧桿菌V9通過在宿主腸道的有效定植調節了PCOS患者的腸道微生物群，并恢復了他們體內的性激素水平。此外，研究表明植物乳桿菌HL2對PCOS大鼠體內卵巢病變有保護作用，并能恢復T、LH和FSH水平[14]。在本研究中，3株植物乳桿菌發酵豆乳和達英-35均顯著降低了PCOS大鼠血清中T的水平，而植物乳桿菌LP4顯著降低了大鼠血清中LH的水平。此外，植物乳桿菌CCFM1019發酵豆乳干預后大鼠血清E2水平顯著提高，在臨床實踐中，PCOS患者由于卵泡發育更加活躍，可能會出現E2水平升高[17]。發酵豆乳干預后使E2升高，這一現象對于PCOS本身而言是否有利仍不清楚。同時，該影響是由益生菌本身造成，還是由豆乳中的雌激素類似物大豆異黃酮造成，還有待于進一步研究。糖代謝紊亂是PCOS患者代謝異常的顯著表現癥狀之一。研究表明[18]，PCOS胰島素抵抗患者體內攝取與利用葡萄糖的能力下降，使得葡萄糖耐量發生異常。此外，血脂異常也是PCOS患者的臨床癥狀之一，主要以血清中TC、TG、LDL-C升高和HDL-C降低為特征[19]。本研究中，植物乳桿菌發酵豆乳干預后，在調節PCOS大鼠OGGT、TG等指標上無明顯效果，與本研究結果相反的是，RASHAD等[20]證明，PCOS患者長期服用益生菌可以調節體內TG含量。原因可能是本研究周期僅為4周，遠遠少于RASHAD等12周的研究周期；同時本研究發酵豆乳活菌數為1×108CFU/mL，遠遠小于RASHAD等研究中的活菌數(1×1010CFU/mL)；此外，本研究選用的是單菌株干預，而RASHAD等選用的是復配菌株干預(德氏乳桿菌和發酵乳桿菌)，也可能是造成本研究中發酵豆乳在調節PCOS大鼠OGGT、TG等指標上無明顯效果的原因。

在本團隊之前的研究中，植物乳桿菌CCFM1019在降低PCOS大鼠血清中E2水平上無顯著效果[14]。而在本研究中，經過豆乳發酵后，植物乳桿菌CCFM1019可以顯著升高PCOS大鼠血清中E2水平。此外，植物乳桿菌LP5在緩解PCOS大鼠的典型病理學表現上無顯著效果，而在本研究中，經過豆乳發酵后，植物乳桿菌LP5可以顯著降低PCOS大鼠體重增加量和血清中T、AST、ALT、TC以及LDL-C含量。這可能是因為發酵豆乳里面含有大豆異黃酮。研究表明[21]，大豆異黃酮可以降低PCOS大鼠體重。此外，本研究采用的是灌胃來曲唑進行PCOS大鼠造模，模型激素呈現高雄激素和低雌激素特點，發酵豆乳干預后，其中的大豆異黃酮可能發揮雌激素樣作用，補充PCOS大鼠體內的雌激素，使得血清中的T水平下降。因此，植物乳桿菌發酵豆乳在一定程度上可能比單獨使用植物乳桿菌(等量CFU)干預更能有效緩解PCOS大鼠癥狀。

在本研究中，3種植物乳桿菌發酵豆乳均可以在一定程度上緩解PCOS大鼠的典型病理學表現。其中，3株植物乳桿菌發酵豆乳均能顯著下調PCOS大鼠血清中T、AST 水平。而CCFM1019發酵豆乳能夠顯著升高PCOS大鼠血清中E2含量，在一定程度上也減輕了PCOS大鼠卵巢病變。相比之下，LP4發酵豆乳可以降低PCOS大鼠血清中LH、ALT以及TC含量，此外，LP5發酵豆乳顯著降低PCOS大鼠體重增加量以及血清中T、ALT、TC以及LDL-C含量。

綜上所述，不僅特定植物乳桿菌菌株具有改善PCOS癥狀的能力，其發酵豆乳同樣具有緩解PCOS的潛力。然而，發酵豆乳的功能性是否依賴于菌株活性并沒有在本研究中得以驗證。滅菌發酵豆乳是否依然具有緩解PCOS的潛力有待于進一步研究。