植物乳桿菌與釀酒酵母共發酵對薏仁米發酵液品質及抗氧化活性的增效性

高維錫，李鋼，李娜

(煙臺職業學院 食品與生化工程系，山東 煙臺，264670)

薏仁米屬禾本科，又名薏米、六谷米等，是一種1年生或多年生草本植物，一直被用作營養膳食補充劑被人們所用[1]。薏仁米不僅富含淀粉、蛋白質、脂肪和多糖等營養成分，還含有豐富的多酚、黃酮和三萜類化合物等多種天然生物活性成分[1]。大量研究表明，薏仁米具有許多有益的健康功效，包括利尿、抗過敏、抗炎[2]和調節免疫系統[3]。我國是薏仁米種植和消費大國，擁有較為完整的薏仁米產業鏈[4]，然而以薏仁米為原料的發酵飲品存在品質差和體外抗氧化活性不高等特點[5]，嚴重限制了其營養和開發價值。探尋薏仁米的高值轉化加工技術成為薏仁米加工企業和廣大科研人員面臨的重要問題。

微生物發酵是谷物生物技術加工中最古老和最經濟的技術之一，因為其可延長谷物的貨架期，并改善谷物的營養價值、風味和生理活性[6]。在谷物發酵過程中，微生物的代謝與谷物成分相互作用，會改變薏仁米淀粉結構、流變和糊化特性及消化率[7]。YIN等[6]研究發現接種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)發酵薏仁米能顯著增加有機酸、游離氨基酸和可溶性膳食纖維的含量。王清爽等[8]研究發現干酪乳桿菌發酵脫脂薏仁米可顯著提高總酚含量和抗氧化活性。XU等[9]研究發現酵母發酵薏仁米會顯著增加低分子質量肽、游離氨基酸及總酚的含量。然而，利用多菌種協同發酵以提高薏仁米的營養和生物學特性的研究鮮有報道。

LP因其保健功能和產細菌素特性是工業發酵最常用的乳酸菌[10]。而釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，SC)作為一種發酵特性優良的發酵劑，可在谷物發酵過程中產生多種水解酶，對谷物產品的結構和生物活性產生重大影響[9]。本研究分別采用LP、SC及其組合發酵薏仁米，探究多菌種協同發酵對薏仁米發酵液營養品質和抗氧化的增效性，為薏仁米的發酵工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：薏仁米，本地超市；LP(CICC20766)、SC(CICC33072)，中國工業微生物菌種保藏管理中心。

試劑：葡萄糖、氫氧化鈉、磺基水楊酸(分析純)，西隴科學股份有限公司；蘆丁、沒食子酸、甲醇(色譜純)，國藥集團化學試劑有限公司；乳酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH自由基清除活性試劑盒、鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power，FRAP)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

DHP-9082生化培養箱，上海東麓儀器設備有限公司；PHS-2F pH計，上海三信儀表廠；UV752N紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；L-8900氨基酸分析儀，日本日立公式；1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液制備

將LP和SC甘油保藏管分別接入MRS和YPD液體培養基進行活化，活化2代后，4 500 r/min離心15 min，棄去上清液，無菌生理鹽水重懸沉淀，分別得到活菌數為2.4×107、3.8×107CFU/mL的LP和SC菌懸液。

1.3.2 薏仁米發酵工藝設計

參考YIN等[6]的發酵方法，并有所改動。取新鮮、無蟲的干薏仁米，加入3倍質量的溫水浸泡3 h，瀝干水分置于墊有紗布的蒸籠中，105 ℃蒸煮15 min，將煮熟的薏仁米用2倍質量的無菌水進行打漿，分別加入0.1%(質量分數)α-淀粉酶(10 000 U)和0.2%(質量分數)纖維素酶(8 000 U)，60 ℃酶解4 h，裝入無菌玻璃罐，分別接種1% LP菌懸液、1%SC菌懸液和1%LP菌懸液及1%SC菌懸液的組合(LP+SC)，混勻后置于37 ℃ 培養箱發酵36 h，得到發酵薏仁米，5 000 r/min離心15 min，收集上清液，-20 ℃冰箱貯存。未發酵的(non-fermented，NF)薏仁米按相同的步驟制備。

1.3.3 生物量測定

參考GB 4789.35—2016 《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行測定；參照GB 4789.15—2016 《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》進行測定。

1.3.4 pH、總酸、還原糖和可溶性蛋白的測定

使用pH計測定各組樣品的pH值；采用GB 12456—2021《食品中總酸的測定》進行測定；利用GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》進行測定；根據考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白的含量[11]。

1.3.5 有機酸測定

根據楊希等[12]的方法，采用HPLC檢測各種有機酸的含量。取適量發酵液，加入等體積的硫酸鋅和亞鐵氰化鉀，8 000 r/min離心15 min取上清液，過0.22 μm濾膜后進行HPLC分析。色譜條件：色譜柱為YMC-ODS C18色譜柱，流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液，流速為0.7 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm[12]。

1.3.6 多肽分子質量分布測定

根據XU等[13]的方法，采用凝膠過濾色譜法對多肽分子質量分布進行分析。色譜條件：色譜柱為TSK-GEL G2000 SWXL凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm)，流動相為含0.1%(體積分數)三氟乙酸的10%乙腈，流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm[13]。

1.3.7 游離氨基酸測定

參考XU等[13]的方法，采用氨基酸分析儀檢測游離氨基酸的含量。將1 mL發酵液與9 mL 50 g/L磺基水楊酸混合均勻，室溫下反應30 min，10 000 r/min離心5 min取上清液，過0.22 μm濾膜后進行氨基酸分析。分析條件：分離柱為TS263離子交換柱，流速為60 μL/min，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為440、570 nm[13]。

1.3.8 總黃酮、總多酚、可溶性膳食纖維和總三萜的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量[14]；利用Folin-Ciocalteu比色法測定總多酚的含量[14]；根據GB 5009.88—2014 《食品中膳食纖維的測定》進行測定；使用香菜醛-高氯酸比色法測定總三萜的含量[15]。

1.3.9 抗氧化活性測定

使用DPPH自由基清除能力試劑盒檢測DPPH自由基清除能力[14][DPPH自由基清除能力以水溶性維生素E(trolox)當量μmol TE/mL表示]及FRAP檢測試劑盒檢測總抗氧化能力[14][總抗氧化能力以亞鐵離子(Fe2+)μmol FE/mL當量表示]。

1.4 數據處理

所有實驗重復進行3次，數據結果以平均值±標準偏差的形式表示。使用GraphPad Prism 8.0和Excel 2017繪制圖表。采用SPSS 21.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同發酵劑對薏仁米發酵液菌落數量的影響

在谷物發酵過程中，酵母菌和乳酸菌的細胞數量對谷物產品品質和香氣有顯著影響[16]。由表1可知，接種發酵劑發酵的薏仁米發酵液中微生物菌落數量均遠高于未發酵薏仁米，但不同發酵劑之間的微生物菌落數量差異較大。發酵36 h后，LP組中LP菌落數量可達8.85 lgCFU/mL，而SC中SC菌落數量則為8.37 lgCFU/mL。LP+SC組中LP和SC的菌落數量分別可達9.22、8.74 lgCFU/mL，均遠高于只接種單一發酵劑實驗組的菌落數量(P<0.05)，表明乳酸菌和酵母菌在薏仁米發酵體系中呈現互利共生的關系。酵母菌分泌的脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶分解基質物質為乳酸菌的生長提供了營養物質，同時以乳酸菌生長過程中產生的乳酸鹽和半乳糖作為能源物質生長繁殖[17]。

表1 各組樣品的LP和SC菌落數量的差異 單位：CFU/mL

2.2 不同發酵劑對薏仁米發酵液基礎理化指標的影響

如圖1所示，發酵36 h后，薏仁米發酵液的pH、還原糖含量和可溶性蛋白含量顯著低于未發酵薏仁米(P<0.05)，而總酸含量則顯著高于未發酵薏仁米(P<0.05)。不同發酵劑發酵樣品之間的基礎理化指標存在較大差異。LP+SC組具有最低的pH和最高的總酸含量，分別為3.96、3.23 mg/mL；其次為LP組，pH和總酸含量分別為3.96、2.94 mg/mL；而SC組中pH和總酸含量分別為5.73、0.52 mg/mL，與LP+SC組和LP組差異明顯。當發酵溫度為37 ℃時，pH快速下降至5.3以下，可抑制沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長[18]。因此，乳酸菌發酵可通過防止病原體的生長確保發酵薏仁米的安全性。乳酸菌和酵母菌的快速生長繁殖會導致薏仁米發酵液中還原糖和可溶性蛋白的迅速減少。LP+SC組具有最低的還原糖和可溶性蛋白含量，分別僅為5.67、0.42 mg/mL；LP組中可溶性蛋白含量則可達0.59 mg/mL；而SC組中還原糖含量為11.31 mg/mL，遠高于LP+SC組。這是由于乳酸菌對還原糖的消耗速率強于酵母菌[19]。發酵環境的酸化會導致發酵體系中可溶性蛋白在大量H+水解作用下降解為氨基酸和多肽[10]。

a-pH；b-總酸；c-還原糖；d-可溶性蛋白圖1 各組樣品的pH、總酸、還原糖和可溶性蛋白的差異Fig.1 The differences in pH, total acid, reducing sugar and soluble protein of each group samples 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 不同發酵劑對薏仁米發酵液有機酸的影響

有機酸是微生物發酵的產物，其含量及比例會導致產品酸感的差異，并決定產品的口感[20]。由圖2可知，未發酵薏仁米上清液中只檢測出草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等4種有機酸，其含量分別為73.04、158.42、22.96、23.62 μg/mL。而接種SC發酵不會改變有機酸的種類，但會改變其含量，檸檬酸和琥珀酸含量分別可達305.64、33.03 μg/mL。此外，在LP和LP+SC組中還檢測到乳酸和乙酸，其中乳酸含量增加最顯著，在LP和LP+SC組的含量分別可達2 150.58、2 312.67 μg/mL，分別占各組整個有機酸比例的72.63%和71.32%。乳酸作為乳酸菌的主要代謝產物，其含量會直接影響薏仁米發酵液的酸感，并且參與酯類化合物的合成[21]。檸檬酸是LP和LP+SC組中含量僅次與乳酸的有機酸，其含量分別可達435.64、538.92 μg/mL，分別占各組整個有機酸比例的14.71%和16.62%。徐磊等[22]研究發現碳水化合物酶協同干酪乳桿菌發酵可增加脫脂薏米水提取液的有機酸總含量，與本實驗結果一致。

2.4 不同發酵劑對薏仁米發酵液多肽分子質量分布的影響

通常，來自植物基蛋白質水解的多肽具有多種生物活性，是一類獨特的功能性食品成分[9]。由表2可知，15 000～10 000 Da的多肽占未發酵薏仁米上清液中整個多肽比例的20.26%，其次為10 000～5 000 Da的多肽。發酵36 h后，15 000～10 000、10 000～5 000、5 000～1 000、1 000～500 Da的多肽比例比未發酵薏仁米顯著降低(P<0.05)，而<180 Da和500～180 Da的多肽則顯著增加(P<0.05)，占發酵薏仁米發酵液中整個多肽比例的72.23%以上，表明發酵薏仁米發酵液中的多肽主要是二肽、三肽和氨基酸。LP+SC組中<180 Da和500～180 Da的多肽比例最高，分別可達40.44%和40.98%。這一結果與XU等[9]的研究結果相一致，說明LP和SC共發酵可將更多的長鏈多肽水解為短鏈多肽和氨基酸。

2.5 不同發酵劑對薏仁米發酵液游離氨基酸的影響

如表3所示，未發酵薏仁米上清液中只檢測出8種游離氨基酸，總含量為22.08 μg/mL。發酵可顯著增加薏仁米發酵液中總游離氨基酸含量(P<0.05)，尤其是LP+SC組的含量最高，可達120.5 μg/mL。未發酵薏仁米上清液中非必需氨基酸含量(13.47 μg/mL)是必需氨基酸(8.61 μg/mL)的1.6倍。然而，發酵36 h后，薏仁米發酵液中非必需氨基酸含量(48.34～59.79 μg/mL)與必需氨基酸(49.05～60.71 μg/mL)無顯著差異。這一結果與XU等[9]的研究結果相一致，表明微生物發酵有助于提高必需氨基酸的比例。精氨酸和脯氨酸分別占未發酵薏仁米上清液非必需氨基酸的42.09%和24.79%。發酵36 h后，天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、精氨酸和半胱氨酸的含量明顯增加。未發酵薏仁米上清液必需氨基酸中組氨酸含量最高(5.48 μg/mL)，其次是賴氨酸(3.13 μg/mL)和酪氨酸(3.13 μg/mL)。發酵后必需氨基酸含量是未發酵薏仁米的5.7～7.1倍。這一結果與YIN等[6]的研究結果相一致，說明必需氨基酸含量的增加來自微生物的代謝和其他氨基酸的轉化。

表3 各組樣品的游離氨基酸含量的差異 單位：μg/mL

2.6 不同發酵劑對薏仁米發酵液總黃酮、總多酚、總三萜和可溶性膳食纖維的影響

由圖3-a和圖3-b可知，未發酵薏仁米上清液中總黃酮和總多酚含量分別為32.53、433.63 μg/mL。發酵可顯著增加薏仁米發酵液中總黃酮和總多酚含量(P<0.05)，分別增加了79.37%～128.07%和68.53%～91.42%。在微生物發酵麥麩中也發現總黃酮和總多酚增加的類似情況[23]。發酵36 h后，LP+SC組中總黃酮和總多酚含量最高，分別可達74.19、830.06 μg/mL，表明乳酸菌和酵母菌共發酵促進黃酮和多酚類化合物的釋放及轉化。谷物中的多酚類化合物以游離和結合形式存在[24]。微生物代謝產生的蛋白酶、纖維素酶和果膠酶可從不溶性基質中釋放結合酚類化合物，并將其水解為游離形式，增加發酵產物中多酚含量[9]。如圖3-c和3-d所示，未發酵薏仁米上清液中總三萜和可溶性膳食纖維的含量分別為10.65、133.05 μg/mL。發酵后各組薏仁米發酵液中總三萜和可溶性膳食纖維的含量均顯著增加(P<0.05)。其中，LP+SC組中總三萜和可溶性膳食纖維的含量最高，分別可達30.34、212.55 μg/mL，分別比未發酵薏仁米提高了184.88%和59.78%。乳酸菌和酵母菌互利共生生成更多的淀粉酶和蛋白酶，促進三萜類化合物和可溶性膳食纖維溶出及合成。發酵后產生的三萜類化合物和可溶性膳食纖維可能增加薏仁米發酵液的益生功效。

a-總黃酮；b-總多酚；c-總三萜；d-可溶性膳食纖維圖3 各組樣品的總黃酮、總多酚、總三萜和可溶性 膳食纖維的含量差異Fig.3 The differences in the contents of total flavonoids, total polyphenols, total triterpenes and soluble dietary fiber of each group samples

2.7 不同發酵劑對薏仁米發酵液抗氧化的影響

DPPH自由基清除活性和還原能力通常被用來評估目標物抗氧化活性強弱。由圖4可知，未發酵薏仁米發酵液的DPPH自由基清除活性和FRAP分別為2.59 μmol TE/mL和3.12 μmol FE/mL。發酵后各組薏仁米發酵液中DPPH自由基清除活性和FRAP均顯著增加(P<0.05)。LP組中DPPH自由基清除活性和FRAP分別為3.43 μmol TE/mL和3.87 μmol FE/mL，而SC組DPPH自由基清除活性和FRAP則分別為3.13 μmol TE/mL和3.96 μmol FE/mL。LP+SC組的DPPH自由基清除活性和FRAP最強，分別可達3.52 μmol TE/mL和4.04 μmol FE/mL。這可能與乳酸菌和酵母菌的代謝產物及薏仁米發酵液中活性物質變化有關[9]。徐磊等[25]研究結果表明不同蛋白酶血糖干酪乳桿菌發酵可以提高脫脂薏米水提取液的抗氧化能力，與本實驗結果一致。

a-DPPH自由基清除活性；b-FRAP圖4 各組樣品的抗氧化活性的差異Fig.4 The differences in antioxidant activity of each group samples

3 結論

本文將LP、SC及其組合用于薏仁米發酵，研究不同發酵劑微生物的變化及其對薏仁米發酵液基礎理化指標、有機酸、多肽分子質量分布、游離氨基酸、總黃酮、總多酚、總三萜和可溶性膳食纖維及體外抗氧化活性的影響。結果表明，LP和SC在薏仁米發酵過程中表現為互利共生的關系。此外，LP和SC共發酵可顯著提高薏仁米發酵液中總酸、乳酸、總黃酮、總多酚、總三萜和可溶性膳食纖維的含量，加速pH的降低及還原糖及可溶性蛋白的消耗。多菌種混合發酵還會顯著提高薏仁米發酵液中<180 Da和500～180 Da多肽的比例，并增加游離氨基酸的含量，尤其可提高必需氨基酸的比例。本研究發現，LP與SC共發酵薏仁米在品質和抗氧化方面具有增效性，為薏仁米的發酵工藝提供理論依據。