黃參粗多糖對植物乳桿菌CGMCC-15801和鼠李糖乳桿菌CGMCC-16103增殖的影響

葉子晨，王騰，楊云，董俊偉，劉少東，王凱，張詩璇，李星，沈強，劉迪茹*

1(蘭州大學 公共衛生學院,營養與食品衛生研究所，甘肅 蘭州，730000)2(甘肅省農業科學院張掖節水農業試驗站， 甘肅 張掖，734000)3(甘肅省農產品質量安全檢驗檢測中心，甘肅 蘭州，730000)

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，具有改善腸道功能、提高機體免疫力、促進代謝及神經系統發育等功能[1]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)是人體腸道內常見的益生菌，已經在食品中得到了廣泛的應用。益生菌食品在我國的年平均增長率接近20%，放眼全球市場，預計到2022年將達到574億美元[2]，具有巨大的經濟價值和市場前景。發酵乳制品作為益生菌的最佳食品載體，具有營養豐富、口味多樣化、老少皆宜等特點。但發酵乳中的益生菌在貨架期的死亡率高達50%～80%[3]，因此，應針對性地添加益生元，以保護和促進益生菌生長。

益生元是一類不能被宿主機體消化、吸收和利用，但能選擇性地促進體內有益菌的增殖和代謝，從而對機體產生有益作用的物質。常見的益生元有低聚果糖(fructo oligosaccharide，FOS)、菊粉(inulin)以及低聚木糖(xylooligosaccharide，XOS)等聚合度不一的植物性多糖。有研究顯示，植物多糖能夠促進腸道益生菌群(如乳酸桿菌和雙歧桿菌)的增殖和產酸，具有與功能性低聚糖相似的益生元功效[4-6]，因此，植物多糖可作為新型益生元的主要來源，具有較大的研發價值。

黃參是傘形科迷果芹屬(Sphallerocarpusgracilis)植物，有黃葑，野胡蘿卜，加果(青海)，小葉山紅蘿卜(河北宛平)，達扭(四川德格)等別稱[7]。其形似人參，通體金黃，有“小人參”之稱，具有良好的藥用效果及營養價值，食用歷史悠久。黃參多糖(Sphallerocarpusgracilispolysaccharides，SGP)是黃參的主要功效成分，約占干重的3.5%，具有免疫調節[8]、抗氧化[9-10]、降血糖[11]、清除亞硝酸鹽[12]等功效。目前，國內外對SGP的研究主要集中在多糖的提取、組成分析和生理功能等方面，尚無SGP對益生菌發酵、增殖影響的研究。因此，本研究以黃參粗多糖(crudeSphallerocarpusgracilispolysaccharides，CSGP)為原料，研究其單糖組成，在人工胃腸液中的水解度，以及對植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在發酵乳中增殖的影響，對潛在的新型益生元——SGP的應用以及新型共生發酵乳的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃參，甘肅省張掖市山丹縣；纖維素酶(7 000 U/g)，北京酷來搏科技有限公司；胰蛋白酶(4 000 U/g)、豬膽鹽、木瓜蛋白酶(80 000 U/g)，北京索萊寶科技有限公司；純牛乳(蛋白質5%，脂肪5%，非脂乳固體4.5%)，蘭州莊園牧場股份有限公司；植物乳桿菌CGMCC-15801、鼠李糖乳桿菌CGMCC-16103，山東中科嘉億生物工程有限公司；inulin、FOS，北京酷來搏科技有限公司(純度>90%，DP<10)；葡萄糖(glucose,Glu)等單糖標準品，北京酷來搏科技有限公司(純度>99%)；除氯仿、三氟乙酸等為色譜純外，其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

5910R大容量高速冷凍離心機，Eppendorf；A-1000S旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；723 N可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；HPX-150生化培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；6890-5973氣相色譜-質普聯用儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CSGP的提取

取適量黃參根，切塊、粉碎、過80目篩，收集黃參粉，備用。

本實驗采用超聲波聯合復合酶法[11]并加以改進提取CSGP。將干燥后的黃參粉溶于蒸餾水[料液比1∶40(g∶mL)]，調節溶液pH至5.8，加入1.6%(質量分數)木瓜蛋白酶和2.0%(質量分數)纖維素酶，超聲(240 W，61 ℃，25 min)輔助酶解，然后95 ℃滅酶10 min。將酶解液離心(8 000 r/min，15 min)，取上清液，在65 ℃下減壓濃縮，然后加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜。次日再次離心(10 000 r/min，10 min)，取沉淀物，最后真空冷凍干燥，即可得到CSGP。CSGP得率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.2 CSGP中的還原糖、總糖以及蛋白質含量的測定

采用3,5-二硝基水楊酸法(3,5-dinitrosalicylic acid method，DNS)[13]測定CSGP中還原糖的含量；采用SN/T 4260—2015 《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準 出口植物源類食品中粗多糖的測定-苯酚硫酸法》的方法測定CSGP中總糖的含量；采用SN/T 3926—2014 《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準 出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質的測定-考馬斯亮藍》的方法測定CSGP中蛋白質的含量。

1.3.3 CSGP的單糖組成測定

本實驗采用GC-MS方法[11,14]測定CSGP的單糖組成。準確稱取標準品[鼠李糖(rhamnose，Rha)、果糖(fructose，Fru)、阿拉伯糖(arabinose，Ara)、木糖(xylose，Xyl)、甘露糖(mannose，Man)、Glu和半乳糖(galactose，Gal)]各5.0 mg，分別加入8.0 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，在90 ℃水浴中反應30 min，冷卻至室溫后加入0.5 mL乙酰氯，繼續90 ℃水浴30 min。氮氣吹干反應物，加入1.0 mL氯仿萃取，0.22 μm濾膜過濾后，收集濾液進行GC-MS分析。測定條件為：升溫從120 ℃開始，維持5 min后，分階段升溫至250 ℃，維持5 min；流速1 mL/min，檢測溫度250 ℃，進樣器溫度220 ℃，分流比1∶50。質譜條件：電子電離(electron impact，EI)源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，掃描范圍m/z50～540。

準確稱取CSGP 10.0 mg，在3.0 mL(2.0 mol/L)三氟乙酸中于110 ℃水解6 h后，用甲醇反復沖洗水解物，于60 ℃真空干燥，乙酰化反應處理方法同標準品。通過與標準品單糖比較，對CSGP進行了單糖組成分析，用面積歸一化法計算相對摩爾比。

1.3.4 人工胃腸液消化實驗

將CSGP、FOS(陽性對照1)和inulin(陽性對照2)分別配制成1 g/mL的溶液，備用。

采用MOHD NOR等[6]的方法配制人工胃液，并分別調節其pH至1～5。然后取5 mL不同pH的胃液添加到5 mL樣品和陽性對照溶液中，于37 ℃反應6 h(振蕩速率130 r/min)，于第1、2、4、6 h收集反應混合物，測定還原糖的含量。水解度計算如公式(2)所示：

(2)

式中：總糖含量、初始還原糖含量為水解前測得，還原糖釋放量=某時間點的還原糖含量-初始還原糖含量。

1.3.5 發酵乳的制備

將巴氏消毒后的鮮牛乳冷卻至37 ℃，以適當比例接種植物乳桿菌或鼠李糖乳桿菌，然后將接種后的牛乳均分為3組，分別設為實驗組、陽性對照組和空白對照組。實驗組分別添加1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/100mL的CSGP；陽性對照組分別添加同等比例的inulin或FOS，空白對照組不額外添加任何碳水化合物。將各組置于37 ℃培養3 h，然后置于4 ℃冰箱中冷藏，待檢。

1.3.6 菌落計數的方法

于樣品冷藏貯存的第1、7、14、21天，按照GB 4789.35—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗》的方法進行菌落計數。增殖率計算如公式(3)所示：

增殖率/%

(3)

1.3.7 數據處理

所有實驗均重復3次，實驗結果表示為平均值±標準差，實驗中所有數據均采用Origin 2018(OriginLab，USA)軟件繪圖，SPSS 25.0(IBM，USA)軟件進行ANOVA單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 CSGP的理化指標

實驗發現，CSGP得率為(31.0±4.0)%；總糖質量分數為(65.5±4.32)%，其中還原糖質量分數為(18.43±2.19)%，蛋白質質量分數為(0.36±0.18)%。

2.2 CSGP的單糖組成

單糖標準品Rha、Ara、Xyl、Man、Gal、Fru、Glu和CSGP的氣相色譜-質譜圖如圖1所示。對比可知，CSGP主要由6種單糖組成：Rha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal，其摩爾比為16.3∶15.5∶5.1∶8.2∶37.1∶17.8。

a-標準品GC-MS譜圖；b-CSGP GC-MS譜圖圖1 單糖標準品和CSGP單糖組成的GC-MS譜圖Fig.1 GC-MS chromatograms of monosaccharide standards and monosaccharide compositions of crude SGP

2.3 CSGP在人工胃腸液中的水解情況

CSGP在人工胃液中的水解度如圖2-a～圖2-e所示。CSGP與陽性對照的水解度隨著pH的升高而降低，這可能是由于在較低pH環境中，糖苷鍵更容易發生斷裂，從而導致多糖水解度增加；隨著孵育時間延長，更多的多糖在酸性條件下水解為單糖和二糖[16]，從而水解度也逐漸增大。在同一pH條件下，CSGP的水解度都顯著低于同一時間點的陽性對照(P<0.05)，說明CSGP比FOS和inulin更能抵抗胃酸的水解，這可能與其單糖組成、糖苷鍵類型不同有關。通過GC-MS分析了CSGP的單糖組分，發現其主要由Rha、Ara、Man、Xyl、Glu和Gal組成，而FOS和inulin主要由Glu、Fru組成。人體胃液的pH為0.9～1.8，進食后胃液pH為2～4，食物通常在胃中保留2 h左右，然后進入腸道。當CSGP在pH=2～4的人工胃液水解6 h后，CSGP的水解度分別為1.60%、1.10%、0.65%，表明至少能有98.40%的CSGP可耐受胃液的水解到達腸道。圖2-f為CSGP與陽性對照在人工腸液中的水解情況。CSGP與陽性對照的水解度隨著消化時間的延長而升高，3者之間的水解度無顯著性差異。當水解6 h后，CSGP的水解度僅為0.11%。因此，可認為CSGP在人工胃腸液中幾乎不水解。

2.4 植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌在貨架期的數量變化

有研究[17]發現，中藥中的多糖類成分，尤其是補益類中藥對益生菌生長具有一定的促進作用，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在貨架期的數量變化情況如圖3所示。由圖3-a和圖3-d可知，在整個貨架期期間，實驗組的植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌菌落總數均在108數量級以上，均高于空白對照(P<0.05)，隨著CSGP添加量的變化，植物乳桿菌在第21天的菌落總數是第1天的1.51～2.80倍；鼠李糖乳桿菌在貨架期第21天的菌落總數是第1天的2.04～5.04倍，這表明CSGP可有效促進植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的生長增殖，減緩植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的死亡。

a-人工胃液pH=1；b-人工胃液pH=2；c-人工胃液pH=3；d-人工胃液pH=4；e-人工胃液pH=5；f-人工腸液圖2 CSGP在人工胃腸液中的水解情況Fig.2 Hydrolysis of CSGP in artificial human gastrointestinal fluid

a-植物乳桿菌/CSGP；b-植物乳桿菌/FOS；c-植物乳桿菌/inulin；d-鼠李糖乳桿菌/CSGP；e-鼠李糖乳桿菌/FOS；f-鼠李糖乳桿菌/inulin圖3 植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在貨架期的菌落數量變化情況Fig.3 Viable cell counts of L.plantarum and L.rhamnosus during shelf life 注：組間多重比較采用LSD法；同一柱狀圖上方不同的小寫英文字母，表示差異顯著(P<0.05)

由圖3-a～圖3-c可知，與空白對照組對比，實驗組和陽性對照組中的植物乳桿菌菌落總數在貨架期第1～14天逐漸增多，第14～21天逐漸減少，呈先增后減的趨勢(P<0.05)；菌落總數增加可能與其耐受低pH有關；此外，其代謝產物如小分子酸、細菌素以及過氧化氫等活性物質會形成化學屏障，保護自身免受外界干擾[18]；后期減少可能與環境pH過低有關，長期處于低pH環境，會使乳桿菌的膜電荷發生改變，影響細胞通透性，進而影響乳桿菌對營養物質的吸收和胞內酶的活性，使乳桿菌生長受到抑制，甚至死亡[19]。由圖3-d～圖3-f可知，實驗組中的鼠李糖乳桿菌的菌落數量在貨架期內呈持續增加趨勢，在1～7 d，菌落數量增加迅速，7～21 d，菌落數量增加相對緩慢，空白對照和陽性對照組的變化趨勢與其基本一致，但在整個貨架期的菌落數量增加相對緩慢。植物乳桿菌主要發酵Glu、Xyl、Man和Gal，鼠李糖乳桿菌主要發酵Glu、Rha和Gal，而CSGP中的Rha、Ara、Man、Glu和Gal含量相對較高，有利于促進這兩株菌的增殖。

由圖3可知，以整個貨架期內植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的活菌總數為考察指標，對植物乳桿菌增殖具有最強促進作用的CSGP、FOS和inulin添加量分別是2.5、3.5、3.0 g/100mL；對鼠李糖乳桿菌具有最強促進作用的CSGP、FOS和inulin的添加量分別3.0、2.5、3.0 g/mL，比較CSGP和陽性對照物在各自最適添加量下對乳桿菌增殖率的影響，可進一步評價CSGP的潛在益生元效用。

圖4反映了乳桿菌在各碳水化合物的最適添加量下的增殖率。由圖4-a～圖4-c可知，當CSGP和陽性對照的添加量均為2.5、3.0或3.5 g/100mL時，植物乳桿菌增殖率先增后減，第14天達到最大值，CSGP組的增殖率分別是258%、386%、410%，分別是同期FOS組增殖率的4.65、6.71、5.09倍，是同期inulin組增殖率的7.45、9.63、8.99倍；由圖4-d和圖4-e可知，當CSGP和陽性對照的添加量均為2.5、3.0 g/100mL時，鼠李糖乳桿菌增殖率隨時間持續增加，在第21天達到最大值，CSGP組的增殖率分別是260%和405%，分別是同期FOS組增殖率的11.35、36.52倍，是同期inulin組增殖率的12.15、11.67倍。綜上所述，實驗組增殖率明顯高于陽性對照組，表明CSGP對促進植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的增殖效果顯著優于FOS和inulin，可以推測CSGP可能是潛在的益生元，其益生性能比FOS和inulin更好。

a-植物乳桿菌/2.5 g/100mL添加量；b-植物乳桿菌/3 g/100mL添加量；c-植物乳桿菌/3.5 g/100mL添加量；d-鼠李糖乳桿菌/ 2.5 g/100mL添加量；e-鼠李糖乳桿菌/3 g/100mL添加量圖4 在CSGP、FOS及inulin的最適添加量下，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在貨架期的增殖率Fig.4 The proliferation rate of L.plantarum and L.rhamnosus during shelf life with the optimal addition amount of CSGP, FOS and inulin

3 結論

CSGP在人工胃液中的水解度僅為2.0%，當CSGP的添加量分別為3.5、3.0 g/100mL時，貨架期中的植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的增殖率分別高達410%和405%，說明CSGP能顯著促進這兩種益生菌在貨架期的增殖，提高益生菌的活性。因此，可以推測CSGP是一種潛在的益生元，然而其益生元特性還需要結合體內實驗進一步驗證。