棉纖維固定化酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇研究

鄧衍宏，劉慶國，汪虎，應漢杰，陳勇*，李義

1(宿州中糧生物化學有限公司，安徽 宿州，234000)2(南京高新工大生物技術研究院有限公司，江蘇 南京，210032) 3(吉林中糧生化有限公司，吉林 長春，130033)

傳統(tǒng)的大宗生化品發(fā)酵模式依然采用大接種量的單批次發(fā)酵，如燃料酒精、氨基酸、有機酸和酶制劑等，發(fā)酵工藝優(yōu)化改進空間有限，而生產(chǎn)成本最高的部分——料問題短期內(nèi)也無法得到有效緩解，所以生產(chǎn)企業(yè)在未來競爭中生存的根本是發(fā)酵技術的創(chuàng)新[1-2]。傳統(tǒng)發(fā)酵工藝主要存在2個方面的缺陷:一是生物催化劑耐受性差，易失活。細胞是由蛋白質、磷脂等物質組成的一種柔性結構。工業(yè)環(huán)境中有機酸、高濃度鹽類、H+等化學物質的侵入容易使其失去生命功能。由于細胞耐受性差，生物反應體系的最終產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)過程效率均低于化學催化體系。二是生物催化劑易老化。微生物細胞隨著時間的推移細胞增殖和分化的能力逐漸衰退,自溶現(xiàn)象嚴重，導致發(fā)酵過程的合成能力下降和催化劑浪費的現(xiàn)象,從而表現(xiàn)為底物轉化效率低[3]。

解決上述問題的最佳途徑是固定化發(fā)酵技術。常規(guī)固定化載體包括海藻酸鈣、卡拉膠、聚乙烯醇凝膠等[4-5]。然而，高攪拌環(huán)境嚴重影響了固定化技術的可行性。表面固定化技術作為一種新型表面固定化方法以多方面優(yōu)勢而越來越受到世人關注。短短20年期間，發(fā)展非常迅速，應用越來越廣泛。利用棉纖維作為表面固定化材料具有成本低、比表面積大、吸附效果好以及表面基團易于修飾改性等優(yōu)點。目前已經(jīng)在有機酸、酶制劑以及工業(yè)污水處理等應用中實現(xiàn)了實驗室或小試規(guī)模的成功驗證[6-9]；尤其在燃料乙醇方面，陳勇研究團隊已經(jīng)完成了320 t發(fā)酵罐規(guī)模的示范試驗研究[5]。

本研究基于前期研究的基礎上，采用化學修飾的方式對纖維載體進行基團修飾，以提高菌體吸附能力，進行定量化的固定化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的研究，為工業(yè)化應用提供更為精準的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

安琪耐高溫活性酵母粉。

1.1.2 固定化載體

固定化載體為棉纖維，采用化學修飾劑為(F6)進行化學改性，用量是毛巾質量的10%(-1)、25%(-2)和50%(-3)。在95%乙醇中浸泡毛巾，42 ℃下?lián)u床(轉速200 r/min)中振蕩反應48 h。反應結束后，用純水清洗10次，并進行凍干處理備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：麥芽汁固體培養(yǎng)基(麥芽250 g/L磨碎過濾加瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min，備用)。種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、磷酸二氫鉀1.5、硫酸銨4、硫酸鎂0.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5、蛋白胨5、葡萄糖230、磷酸二氫鉀3、硫酸銨4、硫酸鎂 0.5、七水合硫酸亞鐵0.05、七水合硫酸鋅0.05。

1.1.4 儀器與設備

1260高效液相色譜，安捷倫；752 N分光光度計，上海儀電；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；JSM-6010掃描電鏡，JEOL；XSP10顯微鏡，萬衡儀器。

1.2 實驗材料

1.2.1 種子培養(yǎng)

挑取1環(huán)經(jīng)麥芽汁活化的斜面種子于200 mL滅菌過的種子培養(yǎng)基中，并置于溫度30 ℃、轉速150 r/min的搖床培養(yǎng)18 h。

1.2.2 菌種擴大培養(yǎng)及固定

將裝有4 g呈正方形棉纖維(2.5 cm×2.5 cm×2 mm)的500 mL的錐形瓶加入200 mL新鮮種子培養(yǎng)基，115 ℃滅菌15 min。冷卻至室溫后，量取10%(體積分數(shù))的種子液加到錐形瓶中。再置于30 ℃搖床上固定16 h。

1.2.3 固定化細胞發(fā)酵

將固定結束后的廢液倒出，加入新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，于溫度33 ℃，轉速100 r/min的搖床上培養(yǎng)若干時間(以不產(chǎn)氣泡及糖降至3 g/L以下為準，下同)。該實驗為破壞性實驗，每批次設3個平行搖瓶，每批次樣培養(yǎng)結束倒出發(fā)酵液測溶液OD600值，用血球計數(shù)板統(tǒng)計細胞數(shù)、出芽率和死亡率。瓶中載體加入200 mL純水振蕩，并整體倒入1 L的燒杯中，超聲振蕩解離出酵母細胞，將載體取出，燒杯中的液體檢測OD600值，用血球計數(shù)板統(tǒng)計細胞數(shù)、出芽率和死亡率，并取10 mL離心測量菌體體積。測完后排出液體，將載體放回燒杯，重新倒入200 mL純水解離細胞，清液檢測OD600值，再重新加水洗，然后再重復2次，即加水4次。

1.2.4 游離細胞發(fā)酵

500 mL的錐形瓶加入200 mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，設3個平行樣。115 ℃滅菌15 min。冷卻至室溫后，量取10%(體積分數(shù))的種子液加到錐形瓶中。再置于溫度33 ℃、轉速100 r/min的搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)若干時間。結束倒出發(fā)酵液測溶液OD600值，用血球計數(shù)板統(tǒng)計細胞數(shù)、出芽率和死亡率。

1.2.5 分析方法

OD值測定：游離酵母：稀釋一定倍數(shù)，通過可見分光光度計，在波長為600 nm的條件下檢測。固定化酵母：通過振蕩從棉纖維上解離下來，然后用上述方法測得OD值。

細胞數(shù)測定：血球計數(shù)法，取2.5 mL混勻樣品放入100 mL容量瓶中，加1 mL次亞甲基藍；定容、靜置1 min，置于血球計數(shù)板上，用顯微鏡計量細胞個數(shù)，其中，死亡率計算如公式(1)所示：

(1)

葡萄糖測定：生物傳感分析儀SBA。

乙醇測定：氣相色譜：初始柱溫70 ℃，升溫速率20 ℃/min，終止溫度為190 ℃；前進樣口溫度180 ℃；前檢測器溫度220 ℃；氫氣流速30 mL/L，空氣流速200 mL/L，氮氣流速30 mL/L。相關計算如公式(2)～公式(4)所示：

(2)

(3)

(4)

掃描電鏡：參照文獻[10]。

2 結果與分析

2.1 不同轉速對菌體吸附的影響

如圖1所示，轉速越高，游離酵母數(shù)越高，說明菌體吸附量越低，故轉速過大不利于菌體吸附。棉纖維對菌體的吸附作用是利用載體和細胞表面所帶電荷的靜電引力，使細胞吸附于載體上。載體對微生物的吸附主要是細胞表面與載體表面間的范德華力和離子型氫鍵的靜電相互作用的結果，這種作用力相對較弱[11-12]。而當轉速過低，如轉速40 r/min時，游離酵母數(shù)幾乎為0，這是由于菌體大量沉淀，并非由于吸附的作用，此轉速下，菌體由于自身重力較大，下沉作用遠遠大于橫向吸附的作用，故轉速過低，也不利于菌體吸附。當轉速為80 r/min時，無菌體沉淀現(xiàn)象，游離酵母數(shù)較低，說明菌體已經(jīng)幾乎被完全吸附。考慮后面不同修飾作用對載體吸附能力評估實驗，故將轉速定為100 r/min相對較佳，此時菌體吸附比例為71.2% (初始OD值為12.10)。

2.2 固定化載體修飾對菌體吸附的影響

如圖2所示，經(jīng)過F6處理后的載體吸附效果有不同程度提升。F6-1與未修飾的載體對酵母吸附能力差異不顯著(P>0.05)。F6-2、F6-2與未修飾的載體對酵母吸附能力差異顯著(P<0.05)，其中F6-2處理效果更佳。F6-2對酵母吸附量達到83.1%(初始OD值為11.03)，比未處理的固定化載體提高了15.9%。

圖1 不同轉速對載體吸附能力的影響Fig.1 Effect of different rotational speeds on carrier adsorption capacity

圖2 不同處理方法對載體吸附能力的影響Fig.2 Influence of different treatment methods on carrier adsorption capacity

從電鏡照片上看(圖3)，處理過的載體表面(圖3-b)相比未處理的(圖3-a)更為粗糙。由圖3-c可明顯發(fā)現(xiàn)，菌體易于在粗糙的表面聚集生長。另一方面研究表明，酵母在酸性環(huán)境下表面攜帶正電荷[13]。當棉纖維表面羥基與硅氧烷發(fā)生耦聯(lián)反應，使得棉纖維引入丙烯酸基團而呈負電荷特性。故修飾后的載體與酵母的結合能力進一步提高。結果表明，F(xiàn)6-2對載體的修飾是有效的，且修飾后的載體對菌體吸附效果也是顯著的。

a-未處理載體表面；b-化學處理載體表面； c-修飾載體表面吸附的酵母圖3 載體表面電鏡照片F(xiàn)ig.3 Electron microscopy of carrier surface

2.3 游離發(fā)酵與反復批次發(fā)酵對比

發(fā)酵終點以不產(chǎn)氣泡及殘還原糖降至3 g/L以下為準。從表1看，固定化發(fā)酵周期呈現(xiàn)下降趨勢，相應的產(chǎn)率有顯著提高。發(fā)酵至6批時發(fā)酵周期縮短至18 h，產(chǎn)率達到6.33 g/(L·h)。乙醇濃度和轉化率值較為穩(wěn)定。發(fā)酵6批的平均轉化率和產(chǎn)率分別為96.77%和5.22 g/(L·h)，相比游離發(fā)酵，分別提高3%和51.7%。相關研究表明，固定化載體可促進菌體形成明顯的生物膜，降低細胞毒害作用。同時由于顯著的菌群優(yōu)勢使得反應速率大幅提高[14-16]，本文研究結果與文獻報道的結果相一致。

表1 各批次發(fā)酵指標Table 1 Fermentation indexes of each batch

2.4 細胞集群效應分析

從表2中可發(fā)現(xiàn)，游離發(fā)酵體系中，3個平行樣結果差距不明顯，說明平行效果較好。游離發(fā)酵總細胞數(shù)近2.5×108個/mL，發(fā)酵終點死亡率較高、出芽率較低。

從圖4-a可明顯發(fā)現(xiàn)，游離細胞部分呈現(xiàn)不飽滿形態(tài)。這主要由于高酒度低營養(yǎng)環(huán)境中游離酵母在攪拌的剪切作用下更易發(fā)生衰退現(xiàn)象[16]。

a-游離酵母；b-固定化酵母圖4 載體表面電鏡照片F(xiàn)ig.4 Electron microscopy of carrier surface

在固定化發(fā)酵體系中，如表3所示，游離酵母細胞為0.9×108個/mL左右，濃度較為恒定。而載體上吸附菌量隨著批次增加呈現(xiàn)上升趨勢。另外，載體上的菌體出芽率較低，且相比游離細胞，形態(tài)更為完整(圖4-b)，說明細胞生長周期顯著延長。而載體上細胞死亡率相對較高，這可能是由于內(nèi)部菌體受傳質影響引起的死亡現(xiàn)象[17]。總體細胞數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢可能由于每批次的游離細胞部分吸附于載體表面所致。6批培養(yǎng)后菌體吸附量為200×108個/g，(其折算到固定化發(fā)酵體系里為4.03×108個/mL)，固定化發(fā)酵體系總酵母數(shù)為4.86×108個/mL，是游離發(fā)酵體系的2倍。這與上述2種模式發(fā)酵速率之間的差別結果較為一致。祝英等[18]對比了海藻酸鈣凝膠法、瓊脂凝膠法、明膠-戊二醛交聯(lián)法和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)對酵母固定化發(fā)酵影響，發(fā)現(xiàn)8%的PVA發(fā)酵效果更佳，載體吸附量為8×108個/g，發(fā)酵48 h酒度為10%～11%，即對應的反應速率近2 g/(L·h)，是游離發(fā)酵速率的2～3倍。相關研究表明，細胞吸附于載體后大量增殖，形成密集的菌群，進而顯示出集群效應[19]。集群效應使群體成員之間實現(xiàn)生理協(xié)同作用，提高整個種群的代謝活力和生存能力[14]。吸附固定化方法克服了傳統(tǒng)包埋、交聯(lián)和共價結合法的缺陷，既能使細胞聚集發(fā)揮作用，又不會對細胞本身的活性產(chǎn)生顯著影響[20]。集群效應提高了菌群優(yōu)勢，從而表現(xiàn)為較強的催化效率。

表3 固定化細胞發(fā)酵體系酵母生長情況Table 3 Yeast growth of immobilized cell fermentation system

3 結論與討論

(1)載體對菌體的吸附與轉速有顯著相關性，較高與較低均不利于酵母細胞吸附，轉速為100 r/min時效果最佳，菌體吸附比例達71.2%。

(2)經(jīng)過F6-2處理后的載體吸附效果有明顯提升，其吸附比例達到83.1%，比未處理的固定化載體提高了15.9%。處理過的載體表面相比未處理的更為粗糙，菌體易于在粗糙的表面聚集生長。

(3)固定化發(fā)酵穩(wěn)定性較好，發(fā)酵6批的平均轉化率和產(chǎn)率分別為96.77%和5.22 g/(L·h)，相比游離發(fā)酵，分別提高3%和51.7%。

(4)固定化發(fā)酵6批后菌體吸附量為4.03×108個/mL，總酵母數(shù)為4.86×108個/mL，是游離發(fā)酵體系的2倍，這可以定量地解釋2種模式發(fā)酵速率之間的差異性。