QuEChERS-HPLC測定柚類果實中檸檬苦素類化合物

鐘世歡，陳青俊 *，王京，葉佳明，楊琳，王岳，陳云義，孫崇德

1(贊宇科技集團股份有限公司，浙江 杭州，310030)2(浙江公正檢驗中心有限公司，浙江 杭州，311305) 3(浙江大學(xué) 果實品質(zhì)生物學(xué)實驗室，浙江 杭州，310058)

柚子在我國栽培時間悠久，種植面積廣，具有清香、涼潤等優(yōu)良特點，被人們譽為果中珍品之一。檸檬苦素類化合物為一類三萜類物質(zhì)，是植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于蕓香科和楝科植物中，其中蕓香科柑桔屬植物是檸檬苦素類化合物的主要來源。

近年來，隨著研究的不斷深入，檸檬苦素類化合物的生物活性與藥理功能日益受到重視。有研究表明，檸檬苦素類化合物具有顯著的抗癌活性[1-2]，如結(jié)腸癌，胃癌等，還可防治骨質(zhì)疏松癥，提高骨礦物質(zhì)的密度和含量，調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平，抗炎化保護肝臟等[3-4]，檸檬苦素類具有與維生素C相當(dāng)?shù)目寡趸锘钚訹5]，且具有一定抗菌性[6]，可用于食品防腐，在藥品原料和天然食品添加劑方面具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。此外，檸檬苦素類物質(zhì)還具有催眠、抗焦慮、調(diào)節(jié)細胞色素及改善心腦血管循環(huán)的作用[7]。在農(nóng)業(yè)方面，檸檬苦素類物質(zhì)被認為具有部分昆蟲拒食、調(diào)節(jié)作物生長等作用，作為植保方面的綠色殺蟲劑，用于生防也具有較好的前景[8]。將其添加至飼料中可增強動物抗應(yīng)激和解毒能力，有利于動物健康，同時還有利于飼料保藏等[9]。

目前國內(nèi)外報道的關(guān)于測定檸檬苦素類化合物的方法有熒光檢測法[10]、分光光度法[11]、放射免疫法[12]、高HPLC法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[13-16]，但主要測定到的物質(zhì)僅局限于檸檬苦素和諾米林，同時測定檸檬苦素、諾米林、黃柏酮3種化合物的方法較少。且大多數(shù)是局限于某一種柚類果實或者相同部位的方法，針對不同種類柚類果實中不同部位的檸檬苦素化合物測定分析尚未有報道。目前帶二極管陣列檢測器(diode array detector，DAD)的HPLC儀應(yīng)用普遍，可對目標物進行純度分析。我國柚類果實加工的大量副產(chǎn)物被當(dāng)作廢棄物丟棄，其中的檸檬苦素類化合物若能被高效合理地利用，將會帶來顯著的經(jīng)濟和社會效益。

本研究采用QuEChERS-HPLC法同時測定柚類果實中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮3種檸檬苦素類化合物，高效便捷，并測定比較了不同品種柚類果實以及不同果實組織部位中含量的差異，為柚類果實中檸檬苦素類化合物在食品和醫(yī)藥等方面利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種檸檬苦素類似物標準品：檸檬苦素(CAS:80226-00-2，純度≥98%)、諾米林(CAS:1063-77-0，純度≥98%)、黃柏酮(CAS:751-03-1，純度≥98%)，中國藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇均為色譜純，賽默飛世爾科技；磷酸(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；試驗用水為超純水。

樣品均為種植基地采摘的‘楚門文旦’、‘早熟暹羅柚’、‘五布紅心柚’、‘強德勒柚’、‘舒化柚’、‘脆香甜柚’和‘馬家柚’，將果實的果肉、囊衣、白皮層、油胞層4個部位分離，經(jīng)冷凍粉碎后，四分法縮分出適量備用。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀，帶DAD檢測器，美國Agilent公司；AR2140電子分析天平，常州奧豪斯儀器有限公司；KS-300EI超聲波清儀，寧波海曙科生超聲設(shè)備公司；Centrifug-5804R臺式離心機，德國Eppendorf公司；均質(zhì)器，德國弗魯克公司；Milli-Q純水，美國Millpore公司。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取樣品5.00 g(精確至0.01 g)至離心管，加25.00 mL乙腈，均質(zhì)勻漿，加5.0 g氯化鈉后再次勻漿，放入超聲波中超聲提取20 min，離心分層后取10.0 mL上清液加入裝有900 mg MgSO4，450 mgN-丙基乙二胺(N-propylenediamine，PSA)和50 mg石墨化炭黑(graphitized carbon black，GCB)凈化管中凈化，離心取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后供HPLC分析。

1.3.2 標準溶液的配制

準確稱取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮標準品各0.01 g(精確至0.000 1 g)于同一10.00 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容刻度，得到檸檬苦素、諾米林、黃柏酮質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的混合標準儲備液，在-20 ℃避光保存。將混合標準儲備液用甲醇稀釋配制成系列濃度的標準工作溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18MG(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速1.0 mL/min；進樣量：10.0 μL；柱溫：35 ℃；檢測器：DAD，檢測波長：210 nm；流動相：A為0.2%(體積分數(shù))磷酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件確認

本方法用DAD在190～700 nm對檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的色譜峰進行掃描，選擇210 nm為檢測波長。

本研究選用了3種C18色譜柱，分別為Inertsil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、CAPCELL PAK C18MG (250 mm×4.6 mm，5 μm)，并對其分離效果進行了比較。結(jié)果表明,3種色譜柱在分離效果方面相當(dāng)，目標峰對稱性均良好。相比較3種色譜柱，CAPCELL PAK C18MG (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜分析柱基線波動較小，目標峰附近基線平穩(wěn)，故選之。不同色譜柱分離效果色譜圖見圖1。

流動相選用0.2%磷酸水溶液和乙腈兩相體系進行梯度洗脫，經(jīng)優(yōu)化，確定了表1的梯度洗脫程序，3種檢測目標物得到完全分離。

1-檸檬苦素；2-諾米林；3-黃柏酮(下同) a-Inertsil ODS-3 C18；b-Eclipse XDB C18；c-CAPCELL PAK C18 MG圖1 不同色譜柱分離效果色譜圖Fig.1 Chromatogram of separation effect of different chromatographic column

2.2 提取與凈化

根據(jù)該3種化合物的性質(zhì)，本方法考察了不同溶劑對其提取效率，比較了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷及乙酸乙酯溶液的提取效果。由圖2可知，以乙腈作為提取劑時，3種檸檬苦素類化合物響應(yīng)均高于其他提取溶劑，且測定過程不需要轉(zhuǎn)換溶劑，所以本方法采取乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑提取效果Fig.2 Extraction effects of different solvents

在實際樣品測定時，部分樣品有干擾物存在，本方法考察了3種QuEChERS凈化管對其凈化效果，分別是a(900 mg MgSO4+450 mg PSA+50 mg GCB)，b(900 mg MgSO4+300 mg C18)，c(900 mg MgSO4+150 mg PSA)。該3種凈化管對樣品凈化效果如圖3所示。結(jié)果表明凈化管中的PSA可有效去除糖和有機酸等糖類等極性干擾物，GCB可去除色素等干擾物。測定時比較了通過各凈化管得到的色譜圖峰高，無顯著差異，說明凈化管對樣品中目標物無吸附。如圖3-a所示，3種檸檬苦素類化合物色譜峰對稱，除雜效果明顯，尤其是檸檬苦素色譜峰無雜質(zhì)影響，所以本方法采取a(900 mg MgSO4+450 mg PSA+50 mg GCB)作為凈化管。

a-(900 mg MgSO4+450 mg PSA+50 mg GCB)；b-(900 mg MgSO4+300 mg C18)；c-(900 mg MgSO4+150 mg PSA)圖3 不同凈化管的色譜圖Fig.3 Chromatograms of different purification tubes

2.3 方法線性、檢出限

配制0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL系列質(zhì)量濃度標準工作液，分別注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以標準系列工作液中各組分的濃度為橫坐標，以峰面積的響應(yīng)值為縱坐標，繪制標準曲線。采用逐級稀釋的方法，以3倍信噪比確定檢出限。線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限分別見表2。結(jié)果顯示,檸檬苦素、諾米林和黃柏酮在0.1～200.0 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.4 回收率試驗

在1.3方法條件下，選取‘楚門文旦’樣品，加入適量的混合標準儲備液，按照1.3.1重復(fù)測定6次，由表3可知，各樣品測得加標回收率為99.0%～100.3%，相對標準偏差為1.0%～2.1%。實驗結(jié)果表明本方法精密度和回收率均良好。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equation, correlation coefficient and detection limit

表3 加標回收率結(jié)果(n=6)Table 3 Results of recovery rate(n=6)

2.5 柚類果實含量測定

采用本方法分別測定不同品種柚子果實的果肉、囊衣、白皮層、油胞層不同部位檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量，結(jié)果見表4。4個組織部位中，囊衣中的3種檸檬苦素類似物含量較高，與其他部位差異顯著。3種檸檬苦素類化合物中，檸檬苦素和諾米林的含量高于黃柏酮。幾個柚類果實品種中，‘早熟暹羅柚’、‘強德勒柚’和‘舒華柚’的檸檬苦素類化合物的含量較高，其中‘舒華柚’的囊衣中諾米林含量達678.9 mg/kg。‘脆香甜柚’和‘馬家柚’的檸檬苦素類化合物含量較低，其中‘脆香甜柚’的囊衣中諾米林含量僅為269.7 mg/kg，而‘馬家柚’囊衣中的檸檬苦素含量僅為193.6 mg/kg。

表4 不同品種柚類果實的不同部位中檸檬苦素類化合物含量 單位：mg/kg

3 結(jié)論與討論

本方法建立了檸檬苦素類似物的QuEChERS-HPLC檢測方法，并測定柚類果實中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量。樣品凈化選擇了900 mg MgSO4+450 mg PSA+50 mg GCB QuEChERS凈化管處理方式，有效去除了柚類果實中糖、有機酸、色素等干擾雜質(zhì)。方法操作簡單，快速高效，具有較強抗干擾能力，線性、精密度和回收率均良好。

應(yīng)用本方法測定比較了柚類果實不同品種以及不同果實組織部位中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量，發(fā)現(xiàn)存在較大差異，各組織部位中，囊衣中的檸檬苦素含量最高，且檸檬苦素和諾米林的含量高于黃柏酮的含量。‘早熟暹羅柚’、‘強德勒柚’和‘舒華柚’品種中檸檬苦素類化合物的含量較高量。這一規(guī)律可為柚類果實中檸檬苦素類化合物在食品和醫(yī)藥等方面進行利用研究提供參考。