地錦草總黃酮對腸源性膿毒癥大鼠的腸道保護作用

鄭文賀，閆 超

（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建福州 350004）

由于仍缺乏有效的治療方法，目前膿毒癥及膿毒性休克患者的病死率仍維持在25%～30%和40%～70%［1-3］。近年來，血必凈注射液、參附注射液、姜黃素等藥物因具有“抗菌、抗炎、抗毒”的多靶點調(diào)節(jié)作用，契合了膿毒癥時全身性炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的復雜失衡，在膿毒癥治療方面得到重視［4-6］。因此，中草藥活性成分的抗膿毒癥作用值得進一步去探索。地錦草（Eu ph or bia humifusawilld，EH）系大戟科（Euphorbiaceae）大戟屬（Eu phorbia L i ma）植物。地錦草中含有槲皮素、沒食子酸、沒食子酸甲酯、肌醇、黃酮苷類化合物（山奈素苷類，槲皮素苷類）、單寧類化合物等多種活性化合物，具有多種藥理作用和生物學活性［7-10］。地錦草經(jīng)常被用于治療腸炎、痢疾等腸道疾病，但尚未有研究報道其在腸源性膿毒癥中的作用。早期體外實驗發(fā)現(xiàn)，地錦草總黃酮類化合物具有很強的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用［11-17］。本研究旨在闡明地錦草總黃酮對腸源性膿毒癥大鼠的腸道黏膜屏障的保護作用，為臨床預防和治療腸源性膿毒癥提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 80只健康雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（120±20）g，購于上海市計劃生育科學院研究所實驗動物經(jīng)營部，合格證號：20180006022039。

1.2 實驗藥物 采集福建福州產(chǎn)地的新鮮地錦草全草10 kg，經(jīng)福建師范大學化學系盧玉棟教授團隊，用乙醇浸提法對地錦草總黃酮進行萃取提純，最終獲得30 g地錦草總黃酮黃色粉末，-70℃冷凍保存［17］。精密測量0.8 g地錦草總黃酮粉末，用100 mL注射用水稀釋溶解成8 mg/mL的地錦草總黃酮溶液。

1.3 實驗試劑 水合氯醛、無水乙醇、乙酸異戊酯（國藥集團化學試劑有限公司）；內(nèi)毒素測定試劑盒（福州新北生化工業(yè)有限公司）；TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（賽默飛生物科技有限公司）；PBS緩沖液、電鏡固定液、蛋白酶K、破膜液、DAPI（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G0002、G1102、G1205、G1204、G1012）。

1.4 實驗儀器 小鼠手術(shù)平臺、加溫毯（瑞沃德）；電子稱量器（凱豐集團有限公司）；D3024R臺式高速冷凍離心機（大龍），JB-P5包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；JB-L5凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；KD-P組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；DHG-9140A烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司）；Quorum K850臨界點干燥儀、離子濺射儀IXRF MSP-2S、SU8100掃描電子顯微鏡HITACHI、Nikon Eclipse C1正置熒光顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

2 實驗方法

2.1 分組和處置 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白對照組、膿毒癥組、地錦草對照組、地錦草組，每組20只。各組大鼠均用標準的鼠顆粒飼料（茂華生物）自由喂養(yǎng)。地錦草對照組和地錦草組以地錦草總黃酮溶液作為唯一水源自由喂養(yǎng)，持續(xù)2周，使每只大鼠的總攝藥量均衡；其余2組用注射用水自由喂養(yǎng)。2周后，選擇狀態(tài)良好，體質(zhì)量增加20 g以上的大鼠進行造模。

2.2 膿毒癥模型制備 膿毒癥組和地錦草組采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）建立膿毒癥動物模型［18］。用7%水合氯醛溶液（0.01 mL/g）行腹腔注射麻醉后，取上腹部正中1 cm縱切口入腹，找出闌尾，在距闌尾盲端1 cm處結(jié)扎，再用18 G注射針頭穿刺闌尾盲端3次，擠出綠豆大小糞便，還納闌尾縫合腹腔。空白對照組和地錦草對照組僅開腹取出闌尾后還納，不進行結(jié)扎和穿孔。各組分別于術(shù)后0、4、12 h經(jīng)腹腔注射無菌生理鹽水1.5 mL/kg。選取精神萎靡、毛發(fā)稀松、24 h存活的大鼠進一步檢測血清內(nèi)毒素，明顯升高者為合格的膿毒癥模型。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

2.3 動物生存觀察與取材 各組分別于術(shù)后4、8、16、24 h觀察動物的生存狀態(tài)和累計死亡率。存活的動物于術(shù)后24 h，用7%水合氯醛溶液（0.01 mL/g）行腹腔注射麻醉后，先取1 mL注射器經(jīng)劍突下穿刺心臟，抽取血液2 mL，備用；再開腹，在距闌尾5～10 cm位置的回腸進行標本取材，送檢電鏡，石蠟切片，以及蛋白檢測。

2.4 血清細胞因子及內(nèi)毒素檢測 經(jīng)心臟穿刺取血，3 000 r/min離心20 min，取血清分裝，-70℃保存。采用終點顯色法測定各組血清內(nèi)毒素水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清TNF-α和IL-1β含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.5 透射電鏡掃描觀察回腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)變化 距闌尾5～10 cm位置的回腸進行標本取材，立即修剪成1 mm3的組織塊，浸入電鏡前固定液，固定4 h以上；0.1 mmol/L磷酸緩沖液PB（pH 7.4）漂洗3次，每次10 min；1%鋨酸-0.1 mmol/L磷酸緩沖液PB（pH 7.4）固定2 h；乙醇梯度脫水，每次15 min；100%丙酮浸泡2次，每次15 min；丙酮∶812包埋劑＝1∶1，37℃，浸泡2～4 h；丙酮∶812包埋劑＝1∶2，37℃，滲透過夜；純812包埋劑，37℃，浸泡5 h；包埋后置60℃烤箱聚合48 h，取出樹脂塊備用。樹脂塊于超薄切片機，切成60～80 nm超薄切片，撈于150目銅網(wǎng)上。飽和醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色；HT7800/HT7700透射電鏡下觀察拍照。

2.6 TUNEL染色法檢測回腸組織細胞凋亡情況石蠟切片脫蠟至水，切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37℃溫箱孵育25 min。將玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，將玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。取TUNEL試劑盒內(nèi)適量試劑1（TdT）和試劑2（dUTP）按1∶9混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2 h，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。切片用PBS（pH 7.4）洗滌3次，每次5 min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.7 Western Blot法檢測Occludin蛋白表達 距闌尾5～10cm位置的回腸進行標本取材，-70℃保存。冰上提取回腸黏膜組織總蛋白，并測定總蛋白質(zhì)量濃度。每孔加入50μg純化的蛋白進行SDS-PAGE（12%分離膠）電泳，使用電轉(zhuǎn)移儀于100 V冰浴轉(zhuǎn)印3 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一抗（1∶150），4℃孵育過夜，PBST（pH 7.4）洗滌3次，每次5 min。然后將PVDF膜轉(zhuǎn)入羊抗兔二抗（1∶100稀釋），室溫孵育1 h，以β-actin（1∶2 000）抗體作內(nèi)參。PBST（pH 7.4）洗滌3次，每次5 min。以Image J 1.8.0軟件計算目的蛋白與βactin的比值進行比較。

2.8 統(tǒng)計學方法 使用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。

3 結(jié)果

3.1 4組大鼠24 h累計死亡情況 空白對照組和地錦草對照組大鼠24 h全部存活，活動自如，毛發(fā)光滑，空白對照組糞便呈褐色米粒樣，地錦草組呈乳白色糊狀。膿毒癥組24 h累計死亡率達45%，動物精神萎靡，自主活動喪失，毛發(fā)稀松，無光澤，眼角見血性分泌物，糞便呈黑色糊狀。地錦草組24 h累計死亡率為25%，動物反應(yīng)遲鈍，自主活動減少，毛發(fā)光澤欠佳，眼角無血性分泌物，糞便呈乳白色糊狀。具體死亡情況見表1。

表1 4組大鼠24 h累計死亡情況［n（%）］

3.2 4組大鼠血清內(nèi)毒素、TNF-α和IL-1β的濃度比較見表2。

表2 4組大鼠血清內(nèi)毒素、TNF-α和IL-1β濃度比較（±s，n＝4）

表2 4組大鼠血清內(nèi)毒素、TNF-α和IL-1β濃度比較（±s，n＝4）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與膿毒癥組比較，2）P＜0.05。

IL-1β/（pg/mL）0.385±0.090 27.440±9.2881）0.333±0.126 7.915±1.2931）2）組別空白對照組膿毒癥組地錦草對照組地錦草組內(nèi)毒素/（EU/mL）0.095±0.073 0.378±0.0171）0.073±0.022 0.300±0.0361）2）TNF-a/（pg/mL）1.553±0.332 123.200±34.2501）1.353±0.104 41.100±14.2801）2）

3.3 回腸黏膜細胞凋亡情況 膿毒癥組回腸黏膜細胞呈現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象；而地錦草組細胞凋亡明顯減少，接近于對照組。表明地錦草總黃酮預處理能在膿毒癥時減少黏膜細胞的凋亡發(fā)生，保護小腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性。見圖1。

圖1 4組回腸黏膜細胞TUNNEL熒光免疫染色圖（×200）

3.4 電鏡下回腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)變化 空白對照組和地錦草對照組回腸黏膜表面的微絨毛排列整齊，長度一致，無脫落、融合等現(xiàn)象；上皮細胞間連接緊密；上皮細胞線粒體形態(tài)正常，嵴清晰。膿毒癥組腸黏膜表面的微絨毛稀疏，有脫落現(xiàn)象；細胞間緊密連接打開；上皮細胞損傷嚴重，細胞器結(jié)構(gòu)消失。地錦草組腸黏膜表面微絨毛排列尚整齊；緊密連接僅出現(xiàn)局部的結(jié)構(gòu)模糊；上皮細胞線粒體腫脹，細胞器結(jié)構(gòu)尚存在。表明地錦草總黃酮能保護膿毒癥大鼠回腸黏膜的機械屏障功能完整。見圖2。

圖2 4組大鼠回腸黏膜電鏡結(jié)構(gòu)圖（×1000）

3.5 4組大鼠回腸黏膜組織Occludin蛋白表達比較見圖3。

圖3 4組大鼠回腸黏膜組織Occludin蛋白表達比較

4 討論

腸道是人和動物體內(nèi)最大的細菌庫。本組實驗模型在闌尾穿孔后，腹腔內(nèi)細菌滋生，內(nèi)毒素經(jīng)腹膜吸收入血，導致腸源性膿毒癥的發(fā)生。地錦草具有顯著的抗炎等免疫調(diào)理作用，能顯著降低KKAy小鼠的血清炎癥因子（TNF-α，IL-6）及脂肪因子［19］。既往實驗表明，地錦草黃酮甙苷類和有機酸類對大腸桿菌、鏈球菌、炭疽桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌等多種腸道致病菌，均有不同程度的抑制作用［20］。同時前期實驗發(fā)現(xiàn)，地錦草組和單純膿毒癥組的結(jié)腸腔糞便性狀截然不同，這可能與地錦草總黃酮調(diào)節(jié)胃腸道菌群微生態(tài)的作用有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組血清內(nèi)毒素、TNF-α和IL-1β水平較空白對照組明顯升高（P＜0.05），提示膿毒癥造模均成功。地錦草組血清內(nèi)毒素、TNF-α和IL-1β水平較膿毒癥組明顯降低（P＜0.05），提示地錦草總黃酮能調(diào)節(jié)宿主的免疫功能，顯著抑制腸源性膿毒癥大鼠的全身炎癥反應(yīng)。

生理情況下，腸道細菌不發(fā)生移位，依賴于胃腸黏膜機械屏障的完整性、腸道微生態(tài)平衡構(gòu)成的生物屏障，以及健全的宿主免疫防御系統(tǒng)，共同形成的防護網(wǎng)［21］。腸道機械屏障功能障礙，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用［22-23］。腸黏膜上皮中的緊密連接（tight junctions，TJ），是維護腸道機械屏障功能最重要的結(jié)構(gòu)［24-25］。當緊密連接蛋白表達減少或結(jié)構(gòu)斷裂時，腸黏膜細胞間隙增大，通透性增加。研究已經(jīng)證實，緊密連接蛋白移位和表達在膿毒癥時發(fā)生顯著變化［26］。Occludin蛋白是緊密連接構(gòu)成的主要成分，對緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的維持具有重要意義［27］。研究表明，腸道致病菌及其毒素可以下調(diào)Occludin蛋白表達，破壞緊密連接結(jié)構(gòu)［28］。用乳酸桿菌干預感染大腸埃希菌的小腸上皮細胞，可升高Occludin蛋白和細胞骨架蛋白的表達，使破壞的緊密連接得到修復［29］。本研究結(jié)果顯示，地錦草組的Occludin蛋白水平明顯高于單純膿毒癥組，提示地錦草總黃酮對緊密連接結(jié)構(gòu)有保護作用；小腸電鏡檢查也進一步支持這一結(jié)果。

胃腸道不但是膿毒癥的“發(fā)源地”，更是膿毒癥的“靶器官”。膿毒癥時胃腸道有效血流灌注明顯減少［30］，大量氧自由基、細胞因子和炎癥介質(zhì)等的作用，是造成腸黏膜損傷屏障功能破壞的主要機制［31］。地錦草總黃酮具有較強的清除氧自由基和羥自由基的抗氧化功能，并呈劑量依賴性［17，32］。在小鼠實驗中，它可明顯提高血液中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量［33］，以及血液CAT和GSH-PX活性［34］。實驗結(jié)果顯示，地錦草組回腸細胞的線粒體損傷輕微，細胞凋亡明顯減少，這可能與其顯著的抗氧化作用有關(guān)。

綜上所述，地錦草總黃酮可以從調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)異常、保護腸道黏膜細胞和細胞間緊密連接構(gòu)成的腸道屏障功能以及調(diào)節(jié)宿主免疫功能等方面，多靶點、全方位地對大鼠膿毒癥時的腸道屏障進行有效保護，發(fā)揮“抗菌、抗炎、抗毒”的多重作用。