血清氧化三甲胺與缺血性腦卒中發生風險的相關性研究

羅嘉欣，張傲琪，高瑞江，李自如，朱潤秀，姚遠，*，袁軍*

腦卒中是全球第二大死亡原因，也是造成身體殘疾的主要原因，以急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）最為常見［1］。盡管近年來AIS新發率和復發率正在下降，導致的死亡人數也有所減少［2］，但全世界每年仍有1 500萬人發生AIS，其中中國每年就有超過200萬例新發病例，且患病人群趨于年輕化［3-5］。目前國內外已有的預測AIS的方法包括十年卒中風險方程、新的《弗雷明漢卒中風險概況》和“中風”危險評分卡，但均不足以有效預測AIS的發生風險、指導早期干預策略的制訂。由于傳統危險因素不能完全預測AIS的發生風險［6］，越來越多的預測方法趨向于結合臨床生物標志物評估疾病發生風險［7-8］。因此，探索新的AIS發生風險可能會進一步減輕AIS疾病負擔［9］。

近期大量研究顯示，腸道微生物群與動脈粥樣硬化、心血管疾病及AIS不良功能預后之間存在密切相關性［10-12］。氧化三甲胺（TMAO）轉化為三甲氨（TMA），后者在腸道微生物作用下或再經門靜脈循環進入肝臟被黃素單加氧酶3（FMO3）氧化后生成 TMAO，發揮促進動脈粥樣硬化形成、增加血小板高反應性及促進血栓形成的作用，同時減少膽固醇逆向轉運［13］。本課題組發現，TMAO與AIS發生風險之間可能存在相關性，但尚有爭議［14］。為明確TMAO水平與AIS發生風險之間的關系，本研究采用回顧性研究方法，利用《國家衛生健康委腦卒中篩查與干預項目》篩查的人群資料，分析血清TMAO水平對AIS發生風險的影響，為AIS的預防及早期啟動干預措施提供有價值的理論依據及新型靶點預防思路［15］。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2020年10—12月，基于腦卒中高危人群篩查和干預項目（https://chinasdc.cn），于內蒙古自治區呼和浩特市新城區社區腦卒中篩查人群中隨機抽取500例為研究對象。納入標準：（1）年齡＞40歲，男女不限；（2）身體無嚴重缺陷；（3）患者和/或其家屬知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：（1）有長期服用他汀類藥物或抗凝藥物史；（2）妊娠或哺乳期婦女。本研究遵循赫爾辛基宣言原則，研究方案通過內蒙古自治區人民醫院倫理委員會批準（批號：202100206L）。排除年齡＜40歲12例，既往有腦卒中疾病史56例，拒絕入組30例，長期服用抗血栓藥物1例，妊娠1例，最終納入研究對象399例。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料及實驗室檢查指標 收集研究對象一般資料，包括性別、年齡、腦卒中病史（既往患腦卒中或有短暫性腦缺血發作）、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、心臟病病史、缺乏運動（運動＜30 min/次、次數＜3次/周）、目前吸煙（平均每天吸煙≥1支且持續時間≥1年）、目前飲酒（平均每天飲酒≥50 g且持續時間≥1年）、體質指數（BMI）、篩查時收縮壓，收縮壓＜140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）為正常，≥140 mm Hg為血壓升高；實驗室檢查指標包括：空腹血糖、糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白、TMAO。采集研究對象全血樣本5 ml置入惰性分離促凝真空管，4 ℃保存，1 500 r/min離心10 min（離心半徑為13.5 cm），分離血清，應用三諾安穩+AIR血糖儀檢測空腹血糖，應用卡迪克干式生化分析儀檢測糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白，應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（中國酶免公司生產）檢測TMAO水平。

1.2.2 研究分組 依據國家衛生健康委腦卒中防治工程委員會開展的腦卒中高危人群篩查和干預項目，采用“中風”危險評分卡對40歲以上人群進行AIS發生風險評估，該評估中危險因素共8項：高血壓、血脂情況、糖尿病、吸煙、心房顫動或瓣膜性心臟病、體質量、運動、卒中家族史。高危定義：存在3項及以上上述危險因素或既往有腦卒中病史或既往有短暫性腦缺血發作病史；中危定義：有高血壓、糖尿病、心房顫動任意一種。本研究依據“中風”危險評分卡將研究對象分為正常對照組（n=121）、中危組（n=141）、高危組（n=137）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析；計數資料以相對數表示，多組間比較采用χ2檢驗。TMAO與AIS發生風險相關指標的相關性分析采用Pearson相關分析和Spearman秩相關分析。采用有序多分類Logistic回歸分析探究AIS發生風險的影響因素。鑒于TMAO存在于外周循環中，且其在AIS患者血清中水平較高［12，16］，為進一步明確TMAO作為AIS發生風險生物標志物的潛在價值，繪制TMAO預測AIS發生風險的受試者工作特征曲線（ROC曲線），并計算靈敏度、特異度、ROC曲線下面積（AUC）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同AIS發生風險人群TMAO水平 正常對照組、中危組、高危組TMAO水平分別為（2.86±0.31）、（2.84±0.37）、（3.21±0.33）μmol/L， 三 組 TMAO水平比較，差異有統計學意義（F=50.877，P＜0.01）；其中高危組TMAO水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.001）；中危組TMAO水平與正常對照組比較，差異無統計學意義（P=0.760）；中危組和高危組比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。

2.2 AIS發生風險的單因素分析 三組年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、缺乏運動情況、目前吸煙情況、目前飲酒情況、BMI、篩查時收縮壓水平、空腹血糖水平、糖化血紅蛋白水平、三酰甘油水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；三組總膽固醇、低密度脂蛋白水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。三組均無腦卒中、心臟病病史者。

表1 三組研究對象一般資料及實驗室檢查指標比較Table 1 Comparison of general data and laboratory examination indexes of three groups of research objects

2.3 TMAO與AIS發生風險相關指標的相關性分析TMAO與AIS發生風險單因素分析中差異有統計學意義指標的相關關系，結果顯示，TMAO與年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、目前吸煙、目前飲酒呈負相關關系，與缺乏運動、BMI呈正相關關系（P＜0.05），見表2。

表2 TMAO與AIS發生風險相關指標的相關性分析Table 2 Correlation analysis of serum TMAO with risk factors of acute ischemic stroke

2.4 AIS發生風險影響因素的有序多分類Logistic回歸分析 以AIS發生風險評估分級為因變量（賦值：正常對照組=1，中危組=2，高危組=3），以單因素分析中差異有統計學意義的指標為自變量，進行有序多分類Logistic回歸分析，結果顯示，高血壓病史、糖尿病病史、缺乏運動、目前吸煙、BMI、篩查時收縮壓、空腹血糖、TMAO是AIS發生風險評估分級的獨立影響因素（P＜0.05），見表3，且危險因素間未發現明顯共線性方差膨脹因子，VIF均＜10。

表3 AIS發生風險影響因素的有序多分類Logistic回歸分析Tabl 3 Analysis of the factors possibly associated with acute ischemic stroke using multinomial and ordinal Logistic regression

2.5 TMAO預測AIS發生風險的價值 繪制TMAO預測AIS發生風險的ROC曲線，結果顯示，當TMAO預測AIS發生風險的最佳截斷值為3.28 μmol/L時，靈敏度為62.0%，特異度為91.6%，AUC為0.790〔95%CI（0.737，0.837）〕，見圖1。

圖1 TMAO預測AIS發生風險的ROC曲線Figure 1 ROC curve of serum TMAO in predicting the risk of acute ischemic stroke

3 討論

全球疾病負擔（global burden of disease，GBD）研究數據顯示，中國是世界腦卒中發病率最高的國家之一，與蒙古國、俄羅斯共同構成重要發病帶［17］，有效預判AIS的發生并予以積極、有效的干預措施對降低AIS發病率至關重要。隨著人們生活水平的提高及飲食結構的改變，探究腸道微生物代謝產物與糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病及心腦血管疾病的發生、發展及預后情況的相關性已成為全球熱點研究方向［18-21］。雖然大量研究早已證明炎性因子在AIS及心血管疾病發生中的潛在預測價值［22-23］，但腸道微生物組及其代謝產物在AIS中的關鍵作用直到最近才被認識到。有研究發現，TMAO是心房顫動患者發生AIS的獨立預測因子，有可能改善心房顫動患者的卒中分層［24］。亦有報道指出較高的TMAO水平可能與高血壓患者首次AIS風險增加相關［25］。但國內外尚無直接探索TMAO水平是否為AIS發生獨立危險因素的相關報道。

本研究結果顯示，高危組TMAO水平高于正常對照組、中危組，進一步行有序多分類Logistic回歸分析結果顯示，TMAO是AIS發生風險評估分級的獨立影響因素；同時，TMAO預測AIS發生風險的ROC曲線結果顯示，當TMAO預測AIS發生風險的最佳截斷值為3.28 μmol/L時，靈敏度為62.0%，特異度為91.6%，AUC為0.790〔95%CI（0.737，0.837）〕。為進一步證實本研究結果的可靠性，本研究團隊目前已完成此項目隊列研究的臨床注冊及啟動工作，正在進行定期隨訪。

較高TMAO水平與AIS發生風險之間呈正相關的潛在機制在于：（1）TMAO可促進動脈粥樣硬化形成及斑塊不穩定性增加。TMAO通過誘導內皮細胞和平滑肌細胞炎癥信號傳導和基因表達，促使巨噬細胞轉化為泡沫細胞，從而形成動脈粥樣硬化斑塊［13，26］。GENG等［27］提出，高水平的TMAO可增加巨噬細胞聚集、CD36和促炎細胞因子表達，從而誘導泡沫細胞形成，增加動脈粥樣硬化斑塊活動性，而動脈粥樣硬化斑塊的穩定性可直接影響AIS事件的發生［28］。（2）升高血小板反應性、促進血栓形成。TMAO通過增加組織因子的表達和活性來促進血栓形成，從而增加AIS發生風險［29］。目前認為，TMAO是動脈粥樣硬化疾病發病機制及繼發附壁血栓所致相關疾病的潛在重要中介［12］。這表明TMAO可能作為臨床有價值的評估AIS發生風險的生物標志物，甚至超過了目前使用的危險因素和實驗室檢查指標。也有部分研究認為，抑制TMAO的產生或降低其血清水平可改善由飲食引起的動脈粥樣硬化［30］。因此，TMAO可能成為預防AIS的新型生物標志物和AIS的潛在治療靶點。

本研究尚存在一定的局限性，首先，本研究是單中心研究，存在一定的地域性和選擇性偏移，可能會降低研究結果的價值。其次，本研究采用“中風”危險評分卡預測AIS發生風險，這將導致預測準確性的降低。提高預測效能最直接準確的方法是進行隊列研究，追蹤高危人群AIS的真實患病率，進而判斷TMAO預測效果，目前本研究團隊已開展本項目的隊列研究。再次，本研究未采用穩定同位素稀釋液相色譜串聯質譜法檢測血清TMAO［31］，可能與其他文獻略有偏差，但本研究方向是值得肯定的。最后，本研究中未評估動脈粥樣硬化斑塊穩定性、凝血因子和血小板活性，需要后續研究來明確TMAO水平預測AIS發生風險的機制。

綜上所述，血清TMAO水平升高與AIS發生風險獨立相關，但仍需縱向研究來檢驗和證實這些關聯，為AIS一級預防和治療策略提供新的前景。

作者貢獻：羅嘉欣進行文章構思與設計、負責文獻、資料收集、實驗操作、撰寫論文及文章質控；張傲琪進行實驗操作及文獻資料的整理；高瑞江進行篩查評估、采集血樣及數據整理；李自如進行論文修訂；朱潤秀進行文章質控；姚遠進行研究設計、方案改進、英文修正及文章質控；袁軍對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。