B細胞異位基因2在胰腺癌組織中的表達及臨床意義

袁中電 吳紅偉 沈豐 孫少華 武倫 高嘉良 劉一魁 周文波

1錦州醫科大學國藥東風總醫院研究生規培基地肝膽胰外科 ，十堰 442000；2湖北醫藥學院附屬國藥東風醫院肝膽胰外科，十堰 442000

B細胞異位基因(B cell translocation gene)家族，即BTG家族，作為公認的抑癌基因，被發現于上世紀90年代，BTG2是該家族中首個被鑒定并定位的抑癌基因[1]。BTG2的N-末端結構域包含兩個保守的基因系列，被命名為A盒基因序列和B盒基因序列，其中A盒具有抗增殖的作用，將細胞捕獲在G1/S期[2]，而B盒則可以與許多靶分子結合，參與細胞分裂、DNA修復、轉錄調控和信使RNA的穩定性等過程[3-4]。BTG2在人體組織中廣泛表達，在胰腺、前列腺、肺等器官中高表達。近幾年研究證實，BTG2在肝癌[5]、前列腺癌[6]等多種腫瘤組織中表達下調，其作為一種抑癌基因在腫瘤細胞的增殖、分化以及DNA損傷修復中起重要作用。但其是否參與胰腺癌的發生和發展鮮有報道。本研究通過檢測BTG2在胰腺癌組織中的表達情況，探討其在胰腺癌中的作用機制及臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

收集2015年6月至2020年12月間湖北醫藥學院附屬東風總醫院病理科石蠟封存的46例胰腺癌組織、對應的癌旁組織及肝膽胰外科9例行手術切除的新鮮胰腺癌組織、對應的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)，記錄患者的年齡、性別、CA19-9水平、腫瘤大小、腫瘤位置、分化程度、是否血管侵犯及淋巴結轉移等。

二、胰腺癌及癌旁組織BTG2蛋白表達檢測

采用免疫組織化學染色法檢測石蠟封存的胰腺癌組織及癌旁組織BTG2表達情況。將46例胰腺癌組織石蠟標本制成厚度為4 μm切片，按照試劑盒說明書進行操作。兔抗人 BTG2抗體購自英國abcam公司，工作濃度1∶50，山羊抗兔IgG二抗購自上海碧云天生物技術有限公司，工作濃度1∶200。由兩名病理科醫師盲法獨立閱片，胞質中出現棕黃色或者褐色顆粒定為BTG2表達陽性細胞。根據BTG2染色深度及陽性細胞百分比進行評分：無染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞比例<10%計1分，10%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。兩者得分相乘，積分≥4分為高表達，<4分為低表達[7]。依據BTG2表達水平，將46例胰腺癌組織及癌旁組織分為高表達組和低表達組。

三、胰腺癌及癌旁組織BTG2基因表達量檢測

采用熒光定量PCR法檢測9例新鮮胰腺癌組織及癌旁組織BTG2的表達量。取9例液氮凍存胰腺癌及癌旁組織，解凍后用Trizol提取組織總RNA，紫外線分光光度儀測定RNA純度及濃度。先將RNA逆轉錄成cDNA，按反轉錄試劑盒說明書操作，熒光定量試劑盒購自英國abcam公司。BTG2正向引物序列為5′-CATCATCAGCAGGGTGGC-3′，反向引物序列為5′-CCCAATGCGGTAGGACAC-3′；內參GADPH正向引物序列為5′-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3′，反向引物序列為5′-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3′。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成。RT-PCR反應條件： 50℃ 2 min、95℃ 2 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 59 s，40個循環。通過PCR儀器自帶軟件獲取擴增產物的Ct值，采用公式2-ΔΔCt計算組織BTG2相對表達量。每個樣本重復實驗3次，取平均值。

四、隨訪

患者出院后通過來院復查隨訪或進行電話隨訪。隨訪截至 2020年12月31日，隨訪時間為75～835 d，中位隨訪時間為387 d。

五、統計學處理

結 果

一、胰腺癌及癌旁組織BTG2表達

BTG2蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中均為彌散性胞質表達(圖1)。46例胰腺癌組織中BTG2高表達29例(63.04%)，低表達17例(36.96%)；對應癌旁組織中BTG2高表達38例(82.61%)，低表達8例(17.39%)，癌旁組織BTG2高表達率顯著高于癌組織，差異有統計學意義(χ2=4.45，P=0.035)。

圖1 BTG2蛋白在胰腺癌組織(1A)和癌旁組織(1B)中的表達 (免疫組織化學 ×200)

9例胰腺癌組織中3例為高分化，6例為中低分化。高分化胰腺癌組織BTG2表達量顯著高于中低分化癌組織(0.66±0.07比0.24±0.18)，癌旁組織表達量顯著高于癌組織(1.00±0.00比0.38±0.30)，差異均有統計學意義(t值分別為5.15、-7.32，P值均<0.001)。

二、BTG2蛋白表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關系

46例胰腺癌組織BTG2陽性表達率與腫瘤分化程度、血管侵犯有關，而與腫瘤位置、腫瘤長徑、CA19-9水平、淋巴結轉移、術后肝轉移無關(表1)。

表1 46例胰腺癌組織BTG2蛋白表達水平與臨床病理特征的關系[例(%)]

三、BTG2蛋白表達水平與胰腺癌患者預后的關系

BTG2高表達組中位生存期為525 d，BTG2低表達組中位生存期為266 d，差異有統計學意義(P<0.001，圖2)。死亡風險曲線圖顯示，生存<300 d患者BTG2高表達組與低表達組生存時間差異無統計學意義[(179±69)d比(160±72)d，t=0.58，P=0.571]；生存≥300 d患者BTG2高表達組生存時間顯著長于BTG2低表達組[(616±135)d比(426±113)d]，差異有統計學意義(t=3.50，P<0.001，圖3)。單因素分析結果顯示，腫瘤分化程度、CA19-9水平、血管侵犯、術后肝轉移、BTG2表達水平是影響胰腺癌患者預后的因素；多因素Cox模型分析結果顯示，BTG2表達水平、血管侵犯、術后肝轉移是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素(表2)。

圖2 BTG2蛋白表達水平與胰腺癌患者生存時間的關系

圖3 不同BTG2蛋白表達水平胰腺癌患者的死亡風險曲線

表2 46例胰腺癌患者預后的單因素及多因素分析

討 論

BTG2位于1號染色體長臂的3區2帶上，共編碼158個氨基酸，最初被鑒定為p53誘導基因，其表達受p53依賴機制的調控[8]。此外，BTG2也可以抑制cyclin E的表達，并在無p53、Rb和cyclin D1參與下抑制細胞G1/S期的躍遷[9]。研究證實，肺癌[10]、喉癌[11]、乳腺癌[12]等多種腫瘤組織BTG2表達均明顯下調，并通過多種途徑參與腫瘤細胞的增殖、轉移。本研究結果顯示，胰腺癌組織BTG2表達陽性率及相對表達量顯著低于癌旁組織，高分化胰腺癌組織表達量顯著高于中低分化組織，提示胰腺癌BTG2表達明顯下調，低表達是胰腺組織惡性表型的重要征象之一。

Devanand等[12]發現，BTG2可以通過抑制癌細胞的侵襲和轉移，也可以通過表觀遺傳學沉默減緩腫瘤向周圍組織浸潤性生長，是治療堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子1高表達的轉移性腫瘤的潛在靶標。本研究結果顯示，BTG2低表達與腫瘤分化程度低、血管侵犯有關，提示BTG2可能是抗衡胰腺癌侵襲性的潛在靶點，與BTG2在骨肉瘤[13]、宮頸癌[14]的相關研究結果一致。

Zubair等[11]報道，實體腫瘤中BTG1或BTG2的表達降低通常與惡性細胞行為和不良治療結果相關，其基因產物的表達情況可作為疾病進展的生物標記。文獻報道，BTG2蛋白的表達水平可作為多種癌癥的預后生物標志物，比如三陰性乳腺癌[15-16]、喉癌[17]、肝癌[18]。Wang等[19]報道，BTG2表達水平是影響食管鱗狀細胞癌患者預后的獨立危險因素，BTG2的下調可用作鑒定和預測食管癌進展和放射敏感性的分子標志物。本研究結果顯示，BTG2高表達組中位生存期顯著長于BTG2低表達組，提示BTG2高表達能顯著改善患者預后，術后300 d后BTG2低表達組患者死亡風險隨生存時間延長顯著高于高表達組，說明BTG2對胰腺癌預后的影響主要發生在遠期。單因素分析結果顯示，腫瘤分化程度、CA19-9水平、血管侵犯、術后肝轉移以及BTG2表達水平均與預后有關。多因素分析結果顯示，血管侵犯、術后肝轉移、BTG2表達水平為影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素，即BTG2低表達提示預后較差。

綜上所述，BTG2在胰腺癌組織中表達下調，與胰腺癌的惡性生物學行為相關，BTG2表達水平是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素，其影響主要發生在遠期。但本研究納入BTG2定量分析例數較少，且缺乏表觀遺傳學研究，尚需大樣本以及納入更多因素的研究予以進一步驗證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明袁中電：實驗設計、實驗操作、數據統計、論文撰寫；吳紅偉、孫少華、沈豐：實驗指導、統計學分析；高嘉良、劉一魁：數據統計；周文波、武倫：研究指導、論文修改、經費支持