高脂喂養聯合STZ腹腔注射對MKR糖尿病鼠心肌損傷的觀察

田娜，喻嶸

1.湖南省人民醫院（湖南師范大學附屬第一醫院）中醫二科，湖南長沙 410000；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科，湖南長沙 410007

糖尿病后期合并心肌損傷，是導致糖尿病患者心衰甚至死亡的主要原因，嚴重影響患者的生存以及生活質量。本實驗所采用的MKR鼠，為骨骼肌特異性IGF-1/Insulin雙受體功能缺失鼠，具有胰島素抵抗和β細胞功能障礙雙重表現，發病快、應用簡單、存活率高、穩定性好[1]，是研究糖尿病及其并發癥的理想模型[2-5]。前期研究已證實MKR鼠在12周齡時出現心肌病理改變[6]。為進一步研究MKR鼠糖尿病病程中心肌損傷的表現，探索優化糖尿病合并心肌病的造模方法，本實驗自2018年9月—2019年1月，以10只C57鼠和24只MKR鼠作為實驗對象，觀察高脂喂養結合鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）腹腔注射后的心肌損傷表現，為后期對MKR鼠糖尿病合并心肌病變的深入研究夯實基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 動物 C57BL鼠于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買，實驗前適應性喂養1周，合格證號：SCXK(湘)2016-0002。MKR鼠（純合子）由美國國立衛生研究院Dr.D.LeRoith與Dr.Jun-Li Liu提供，經自然繁殖的子代用于實驗觀察。以上兩者均飼養于湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心，分別采用普通維持飼料（北京華阜康生物科技公司，貨號：1022）和高脂飼料（武漢維通利華公司，貨號：D12492）飼養。本實驗已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1.1.2 主要試劑及儀器 主要試劑有肌鈣蛋白Ⅰ（Cardiac troponin Ⅰ, cTnI）試劑盒、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes, CK-MB）試劑盒（貨號：AKC0325）；STZ（貨號：S0130）；三酰甘油(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 試劑盒（貨號：T9420、BC1985、C061、C063）。主要儀器有血糖儀（貨號：GA-3）；電化學發光全自動免疫分析儀（型號：Elecsys2010）；全自動化學發光免疫分析儀（型號：CL1000i）；正置熒光顯微鏡（日本NIKON公司，型號：Eclipse Ci）；電鏡（日本日立公司，型號：HT7700）。

1.2 方法

1.2.1 分組 連續普通飼料喂飼4周齡C57鼠10只（雌雄各半），并設為正常組；連續高脂飼料喂飼4周齡MKR鼠24只（雌雄各半）。以上小鼠觀察性飼養10周后，MKR鼠遵循隨機、均衡原則分為模型組、空白組，每組12只。模型組MKR鼠禁食不禁水6 h，STZ溶解于檸檬酸鈉緩沖液（濃度為0.1 mmol/L，pH為 4.0）中，連續 5 d以40 mg/kg的劑量腹腔注射[7]；正常組、空白組連續5 d腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液（pH4.0）。繼續觀察性飼養3組小鼠至第15周。

1.2.2 標本采集與檢測 ①一般情況：定時觀察并記錄各組小鼠的毛發、皮膚、飲食、尿液、精神狀況，有無傷口、死亡情況等。②體質量及空腹血糖：（fasting blood glucose, FBG）分別于第1、10周（造模前）、第11周（造模后72 h）、第15周，小鼠禁食不禁水6 h，測量體質量，剪尾靜脈采血檢測空腹血糖值。③脂代謝：第15周后將小鼠麻醉后心臟釆血，血液標本于室溫靜置2 h，分離血清，4℃保存。采用ELISA檢測，遵照試劑說明書使用步驟操作，Elecsys電化學發光全自動免疫分析儀檢測TG、TC、LDL-C、HDLC。④血清cTnI、CK-MB 血清取樣方式同脂代謝：采用ELISA檢測，使用Elecsys電化學發光全自動免疫分析儀檢測cTnI、CK-MB。⑤心肌組織病理形態：處死小鼠后迅速開胸剝離心臟，剪取約3 mm×5 mm×10 mm大小的心肌組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，脫水，分別制成蘇木精-伊紅（HE）染色切片，膠原纖維（MASSON）染色切片和過碘酸-雪夫（PAS）染色切片，光學顯微鏡下觀察心肌組織。同時剪取左心室心肌組織切成1 mm3標本，2%戊二醛液中固定，脫水、浸透、包埋、染色，制成超薄切片，電鏡下觀察心肌超微結構并采集代表性圖像。

1.3 統計方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布，以（）表示，多組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠空腹血糖與體質量變化情況比較

第1～15周，正常組、空白組小鼠體質量均呈平穩增長趨勢；造模前，模型組小鼠體質量呈增長態勢，造模后，第11、15周模型組小鼠體質量較自身第10周時期的體質量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），且明顯低于同期空白組小鼠體質量，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。第1、10、11、15周，模型組、空白組空腹血糖均明顯高于同期正常組小鼠，差異有統計學意義（P＜0.05）；造模后，與空白組對比，模型組血糖明顯更高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。實驗期間，正常組血糖平穩，波動較小，體質量呈增長趨勢；MKR小鼠高脂喂養的情況下，空白組的小鼠血糖升高，體質量小幅平穩增長；而經高脂喂養聯合STZ造模后的MKR小鼠血糖升高顯著，體重下降明顯。

表1 各組小鼠體質量對比［()，g］

表1 各組小鼠體質量對比［()，g］

注：與空白組比較，△△P＜0.05；與本組第10周比較，▲▲P＜0.05

組別正常組（n=12）空白組（n=12）模型組（n=10）第15周32.13±2.34 25.96±3.20（18.65±3.45）△△▲▲第1周25.04±2.20 21.81±2.86 22.09±2.37第10周30.86±2.05 24.45±3.77（24.78±3.77）△△第11周30.95±2.12 24.75±2.99（19.13±3.86）△△▲▲

表2 各組小鼠空腹血糖對比［()，mmol/L］

表2 各組小鼠空腹血糖對比［()，mmol/L］

注：與正常組比較，**P＜0.05；與空白組比較，△△P＜0.05

組別正常組（n=12）空白組（n=12）模型組（n=10）第15周4.52±0.62（11.66±2.01）**（18.26±2.41）**△△第1周4.09±1.05 7.76±1.70**（8.32±1.82）**第10周4.78±0.44（10.93±2.51）**（11.15±2.80）**第11周5.02±0.50（11.58±2.27）**（17.34±3.13）**△△

2.2 各組小鼠脂代謝情況比較

與正常組比較，空白組、模型組TG、TC、LDL-C水平更高，HDL-C比正常組低，差異有統計學意義(P＜0.05)。與空白組比較，模型組HDL-C水平更低，差異有統計學意義(P＜0.05)，2組TG、TC、LDL-C水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠脂代謝對比［()，mmol/L］

表3 各組小鼠脂代謝對比［()，mmol/L］

注：與正常組比較，**P＜0.05；與空白組比較，△△P＜0.05

組別正常組（n=12）空白組（n=12）模型組（n=10）LDL-C 1.52±0.27（2.62±0.43）**（2.64±0.63）**TG 1.29±0.23（2.91±0.55）**（2.93±0.32）**TC 2.57±0.40（4.93±0.80）**（4.52±0.94）**HDL-C 1.84±0.18（1.28±0.18）**（1.01±0.30）**△△

2.3 各組小鼠cTnI、CK-MB水平比較

與正常組對比，空白組、模型組cTnI、CK-MB水平更高，差異有統計學意義(P＜0.05)。與空白組對比，模型組的cTnI、CK-MB水平更高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 各組cTnI、CK-MB 情況對比()

表4 各組cTnI、CK-MB 情況對比()

注：與正常組比較，**P＜0.05；與空白組比較，▲P＜0.05

組別正常組（n=12）空白組（n=12）模型組（n=10）CK-MB（U/L）7.73±0.50（24.99±2.55）**（28.87±2.67）**▲cTnI（ng/mL）1.53±0.13（8.62±0.58）**（9.38±0.62）**▲

2.4 光鏡觀察結果

2.4.1 HE染色 正常組心肌細胞橫紋清晰，排列有序，微血管結構清晰可辨認，間質無異常。模型組、空白組左心室心腔內存在中性粒細胞、淋巴細胞及少量炎性滲出物。空白組左心室壁可見橫切肌纖維細胞腫脹，肌纖維疏松、淡染，心肌細胞中度變性、壞死；微血管結構模糊，管腔輕度狹窄，管壁水腫。模型組左心室心內膜下滲血，左心室壁少量心肌細胞壞死，橫切肌纖維細胞水腫、畸形、無序，肌纖維斷裂，心肌間質增寬，可見心肌細胞變性、壞死，微血管模糊難辨，管壁增厚、腫脹，管腔狹窄。見圖1-1、1-2、1-3。

2.4.2 MASSON染色 正常組心肌間質內和小動脈周分布少量膠原纖維；空白組心肌間質內和小動脈周圍膠原纖維散在分布；模型組心肌組織內膠原沉積，膠原纖維粗大、紊亂、交錯，密集分布于小血管周邊。見圖1-4、1-5、1-6。

2.4.3 PAS染色 正常組無明顯糖原沉積情況；空白組可見糖原沉積；模型組大量糖原沉積。見圖1-7、1-8、1-9。

圖1 光鏡觀察結果

2.5 透射電鏡觀察結果

正常組心肌細胞排列有序，各細胞器形態清晰正常，胞漿內充滿整齊排列的肌原纖維。基帶清晰，線粒體充滿胞漿，內、外膜完整連續，腔內嵴密集而整齊。空白組心肌肌原纖維紊亂，部分肌原纖維變性、溶解；肌絲增生，明暗帶欠清晰；心肌細胞略顯增大，線粒體分布不均，形態異常，嵴欠清晰，量少，但質膜未見破壞，成熟心肌細胞內可見較為完整的肌小節。模型組心肌細胞形態異常腫大、排列無序、結構缺失，肌原纖維分布失常、斷裂、脫落，局部溶解；肌絲紊亂，扭曲分離，肌節形態改變，肌纖維不連續變性，閏盤顯著擴張、改變。線粒體畸形，外膜破壞，嵴稀疏、無序，局部斷裂，結構模糊難辨，部分心肌細胞中線粒體消失，胞核染色質點片狀凝聚，核膜斷裂，分段式消失。微血管壁增厚，管腔狹窄，甚至阻塞。見圖2。

圖2 各組心肌組織電鏡結果

3 討論

目前存在多種糖尿病造模方法，除基因敲除、基因替換等手段外[8-10]，還有STZ、四氧嘧啶等化學藥物誘導法、膳食誘導法等不同的造模思路[11-12]。多項研究表明小劑量連續腹腔注射STZ具有成功率高、死亡率低的優點[13-16]。黎婭等[17]發現高脂喂養12周聯合STZ尾靜脈注射，可成功建立2型糖尿病大鼠模型，但死亡率較高（25%）。據此，本實驗以MKR轉基因糖尿病小鼠為實驗對象，優化造模方式，行高脂喂養聯合STZ腹腔注射5日的造模。實驗中，正常組、空白組均無小鼠死亡；模型組小鼠造模期間死亡1只，第12周死亡1只。正常組小鼠皮毛富有光澤，毛發濃密、旺盛、清潔，精力充沛，反應靈敏，性情溫順。與正常組小鼠相比，空白組MKR鼠進食量、飲水量、尿量較多，墊料潮濕速度較快；小鼠整體精神較亢奮，易躁動，攻擊性較強，雄鼠喜斗毆，傷痕愈合慢；背部毛發較稀疏，少數背部及尾部可見小片狀疤痕。模型組MKR鼠在第1～10周表現同空白組一致；第12周高脂喂養聯合STZ造模后，模型組MKR鼠進食量、飲水量及尿量顯著增多，墊料潮濕速度快，尿液腥臊味明顯，毛發稀疏、潮濕；雄鼠好斗毆，傷痕集中在背部及尾部，部分存在皮膚感染，傷口難以愈合，裸露出淡紫紅色皮膚，實驗后期精神萎靡，不喜活動，皮溫偏低。實驗結果表明造模成功，且經高脂喂養聯合STZ腹腔注射的MKR鼠死亡率低（16.7%），與空白組單純高脂喂養MKR小鼠的表現相比，多食、多飲、多尿，造模后的體重明顯減輕，空腹血糖顯著升高，與糖尿病模型特點更為貼合。

多項研究表明，TG、TC、LDL-C與心血管疾病的發生風險呈正相關，HDL-C呈負相關，對動脈具有一定的保護作用[18-20]。翟鑫等[21]發現胰島素抵抗與TG、LDL-C水平呈正相關，與HDL-C水平呈負相關，高TG、低HDL-C水平將導致胰島素抵抗或代償性高胰島素血癥，而長期的高胰島素血癥又使TG和LDL-C水平升高，并使HDL-C水平降低，由此形成惡性循環，反向加重糖尿病患者的脂代謝異常和胰島素抵抗，最終增加心血管事件的風險。本實驗中模型組與空白組的MKR鼠TG、TC、LDL-C三項血脂指標均比正常組高，二者水平相當，但模型組HDL-C水平更低，由此可知，經高脂喂養聯合STZ腹腔注射造模的糖尿病小鼠血糖、血脂維持在平穩的高水平狀態，具備糖尿病并發心血管事件的高血糖、脂代謝異常兩大高危因素，導致模型組小鼠心血管損傷更為嚴重。

cTnI、CK-MB、光鏡及電鏡觀察結果表明，與正常組相比，模型組及空白組MKR小鼠均存在不同程度的心肌損傷病理表現，符合前期研究結果[6]。而進一步對比模型組和空白組的心肌損傷情況，發現同為經過高脂喂養的膳食誘導作用后MKR糖尿病鼠，采用了STZ腹腔注射造模的MKR鼠，形成了更高的高血糖狀態，并在持續的高血糖、高血脂水平作用下，其心肌損傷更為嚴重，表現為：心肌細胞變形、壞死，肌原纖維結構破壞，線粒體減少，微血管損傷，心肌間質纖維化，心肌整體形態改變，符合糖尿病并發心肌病的特征性病理表現。由此可知，高脂喂養聯合STZ腹腔注射造模可對心肌產生嚴重的損害，使心臟功能受損，加速糖尿病并發心肌損傷的疾病進展。

MKR轉基因糖尿病小鼠作為優良的糖尿病模型鼠，已在前期實驗中發揮重要作用，但心肌損傷程度較輕。本實驗中改進備制方法，本實驗將MKR轉基因糖尿病小鼠與常用造模方法結合，強化造模效果，成功建立糖尿病并發心肌損傷特征典型且死亡率較低的模型，可為糖尿病以及糖尿病合并心肌病模型的建立提供新方向，以便進一步研究該疾病的防治。