竹節參總皂苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的實驗研究

楊 煜，聞 宇，王友聯，呂文偉，康勁松*，李洪巖*

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫院,吉林 長春130041)

心肌缺血可導致心律不齊甚至心力衰竭等嚴重的并發癥，成為對人類健康構成嚴重威脅的疾病之一。竹節參總皂苷主要皂苷成分是竹節參皂苷IV、V和人參皂苷Re等，具有顯著降低中動脈栓塞模型大鼠全血粘度、紅細胞聚集性及增加紅細胞變形性的功效[1-2]，能夠明顯增加Bcl-2蛋白表達，減少Bax蛋白表達，減少凋亡，改善大鼠神經功能的受損程度[3]。缺血再灌注時氧自由基生成增多，對蛋白質、核酸及細胞外基質產生破壞[4-6]，高能磷酸化合物缺乏，總腺苷酸水平減少，同時鈣超載，形成磷酸鈣損傷線粒體功能，使 ATP 產生障礙。本試驗從心肌酶學、心肌細胞凋亡[7]及超微結構方面觀察竹節參總皂苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)模型的治療作用。

1 資料與方法

1.1 實驗資料

1.2 實驗方法

Wistar大鼠50只，隨機分為假手術組、模型組、地奧心血康50.0 mg·kg-1組、竹節參總皂苷50.0 mg·kg-1及100.0 mg·kg-1組，灌胃一周，每天一次。大鼠用乙醚麻醉罐麻醉后，鼠板上仰臥位固定，在心臟周圍剪毛、消毒并做荷包縫合，在左側第3肋間開胸，暴露心臟，用大鼠擴胸器將心臟擠出胸腔，迅速結扎左冠狀動脈前降支1/2處，將心臟迅速送回胸腔，用力擠出胸腔內血液和空氣，收攏荷包關閉胸腔。假手術組僅留線，不結扎左冠狀動脈前降支。30 min后開胸，剪斷結扎線造心肌缺血再灌注損傷模型。120 min后，大鼠腹主動脈插管取血，3 500 r/min，離心10 min，取上清液測定AST、LDH、MDA、SOD、GSH- Px含量。取心尖及左室心肌組織制成1×109/L 細胞懸液，加 Annexin-V-FITC室溫避光反應10 min，加PI混勻室溫避光反應 5 min，于1 小時內用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡指數。切取一小塊梗死區心肌組織，經4%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定，蒸餾水沖洗，乙醇、丙酮由低濃度到高濃度梯度系列脫水，環氧樹脂浸透包埋，高溫聚合后，半薄切片定位到心肌縱切面，再進行超薄切片，最后經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行雙重電子染色，透射電子顯微鏡下觀察超微結構的改變。

2 結果

2.1 竹節參總皂苷對大鼠血清AST，LDH活性及心肌細胞凋亡指數的影響

模型組大鼠血清AST、LDH及心肌細胞凋亡指數均明顯高于假手術組(P<0.001)，說明心肌缺血再灌注損傷模型制備成功。地奧心血康50.0 mg·kg-1組和竹節參總皂苷50.0 mg·kg-1、100.0 mg·kg-1組與模型組比較，AST分別降至模型組含量的70.4%、72.7%和66.7%(P<0.05、P<0.05、P<0.001)。LDH的含量分別降至模型組含量的71.4%、76%和66.1%。(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。心肌細胞凋亡指數則分別比模型組下降了20%、25.9%和27.5%(P<0.001、P<0.05、P<0.001)，具有統計學意義，說明竹節參總皂苷能夠明顯減輕心肌缺血再灌注造成的心肌損傷，結果見表1。

表1 竹節參總皂苷對大鼠心肌缺血再灌注 AST，LDH活性及心肌細胞凋亡指數的影響

2.2 竹節參總皂苷對大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px的影響

從表2中可以看出 模型組血清MDA水平與假手術組相比較明顯升高(P<0.001)，SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.001、P<0.01)。給予地奧心血康50.0 mg·kg-1及竹節參總皂苷50.0 mg·kg-1、100.0 mg·kg-1后，MDA水平明顯降低(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，而SOD及GSH-Px活性明顯升高(P<0.05、P<0.05、P<0.05)。

表2 竹節參總皂苷對大鼠心肌缺血再灌注 MDA、SOD、GSH-Px的影響

2.3 竹節參總皂苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞超微結構的影響

假手術組心肌細胞肌膜連續，于Z線處下陷，肌絲束排列整齊，肌節的結構清晰，線粒體嵴致密、結構清晰,沿長軸整齊地排列在肌絲束之間。模型組心肌細胞胞膜破損，肌絲束排列紊亂、可見廣泛的斷裂溶解改變，有的心肌細胞胞質內肌節合并形成異常的收縮帶，線粒體移位，局部空化，也有部分線粒體呈完全的腫脹空化狀態。與模型組相比較，地奧心血康組心肌細胞超微結構改善明顯，除部分肌絲束仍有輕微斷裂改變外，大部分肌絲束排列整齊,肌節及明暗帶結構清晰，線粒體數量略有減少，但未見空化改變。竹節參總皂苷50.0 mg·kg-1組心肌細胞仍可見部分肌絲束呈輕微斷裂改變，肌絲排列松散,肌節及明暗帶結構尚可，線粒體基質疏松，局部可見空化改變。竹節參總皂苷100.0 mg·kg-1組大部分心肌細胞內均可見到整齊排列的肌絲束,肌節及明暗帶結構清晰，線粒體嵴結構清晰，基質略顯疏松。

3 討論

MIRI發生時，由于能量代謝障礙產生大量氧自由基，自由基進一步損害線粒體，造成線粒體功能障礙，加重能量代謝障礙。這種惡性循環是造成MIRI心肌組織損傷和細胞死亡的重要原因[8]。實驗中觀察到大鼠心肌缺血再灌注后，模型組大鼠血清中心肌酶AST和LDH含量明顯增加，說明有大量的心肌細胞發生損傷，與李玲美等結果一致[9]。而竹節參總皂苷能夠明顯降低血清中AST和LDH的含量，說明竹節參總皂苷能夠減輕缺血再灌注造成的心肌細胞損傷。

大量研究表明，組織缺血再灌注過程中生成的大量自由基可以進一步加劇組織的損傷，使細胞的膜結構和功能遭到破壞。SOD和MDA是目前公認的能反映氧化應激反應程度的指標[10]。MDA是生物膜脂質過氧化反應的代謝產物，其含量間接反映機體組織氧化應激狀態。SOD可直接清除超氧陰離子，是維持機體氧化還原平衡狀態的重要抗氧化酶之一，GSH-Px 具有保護細胞膜的結構及功能不受損害的作用，這些抗氧化酶是體內抗氧化的第一道防線。實驗結果顯示，與模型組相比，竹節參總皂苷可明顯降低血清MDA的含量，增加血清SOD、GSH-Px的含量。說明竹節參總皂苷可能通過增加SOD、GSH-Px的含量，減少缺血再灌注過程中生成的自由基對細胞膜結構和功能的破壞，進而實現對心肌細胞膜結構和功能的保護作用，。在缺血早期細胞凋亡數量甚至多于細胞壞死數量，缺血再灌注過程中心肌細胞超微結構與細胞凋亡呈現相關性[11-12]。模型組大鼠心肌細胞在缺血再灌注后，心肌細胞凋亡指數顯著增高，心肌細胞的超微結構也明顯破壞，可見心肌細胞膜破損，肌絲束廣泛的斷裂溶解，線粒體空化。給予竹節參總皂苷后，心肌細胞的凋亡指數明顯下降。心肌細胞的超微結構也得到了明顯的改善，心肌細胞中僅可見部分肌絲束呈輕微斷裂改變，肌節及明暗帶結構尚可，線粒體未見明顯的空化改變。說明竹節參總皂苷能夠保護心肌細胞的超微結構及減少細胞的凋亡發生。

綜上所述，竹節參總皂苷能夠保護心肌細胞超微結構，減輕心肌的缺血再灌注損傷，其作用機制可能與清除氧自由基，降低脂質過氧化，減少心肌細胞凋亡有關。