NGS法檢測197例非小細胞肺癌突變基因特征分析

房 雪，曲春靜，白元松，代恩勇

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 腫瘤血液科，吉林 長春130033)

肺癌是全球癌癥致死的首位原因，占癌癥致死總數(shù)的18%[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌組織類型，我國NSCLC患者基因變異譜不同于西方人群，高達60%的肺腺癌患者具有已知的致癌基因突變[2]。近年，多項研究[3-5]采用二代測序方法針對晚期NSCLC進行多基因檢測。通過對全景基因突變的了解，能夠更好的指導臨床治療，以臨床實驗為主體的突變分布數(shù)據(jù)可以一定程度上反映NSCLC的驅(qū)動基因分布，特別是少見及罕見基因分布的了解，有助于進一步指導臨床治療。

1 對象和方法

1.1 研究對象本研究收集了2019年12月至2021年9月就診于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院的晚期NSCLC患者197例。回顧性收集患者的人口學、臨床病理學、驅(qū)動基因突變狀態(tài)等資料。所有患者數(shù)據(jù)均取自初診治療前標本(組織或外周血)的檢測結(jié)果。利用第三方NGS平臺行多基因突變檢測，均含肺癌臨床治療指南推薦檢測的肺癌9種驅(qū)動基因(EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2(HER-2)、RET、MET及NTRK)。

1.2 檢測方法所有患者的病理組織均經(jīng)常規(guī)病理確診，癌組織量及血細胞量均足以進行基因檢測，基因檢測平臺：Illumina(NextSeq 550AR/NovaSeq 6000),經(jīng)NGS法進行多種驅(qū)動基因檢測，操作方法和數(shù)據(jù)分析均遵循檢測平臺指南要求。

1.3 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計學分析采用SPSS 25.0軟件行χ2檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義；繪圖采用Microsoft Office Excel 2019及RStudio 4.1.1軟件中R語言pheatmap包進行。

2 結(jié)果

2.1 晚期NSCLC患者驅(qū)動基因分布197例晚期NSCLC患者的基礎(chǔ)信息見表1，驅(qū)動基因總陽性率為74.11%(146/197)，EGFR為主要驅(qū)動基因，突變頻率為48.22%(95/197)，以常見的19外顯子缺失突變(21.83%，43/197)和21外顯子L858R突變(17.77%，35/197)為主，還有20外顯子插入突變和T790M突變各占2.54%(5/197)。其他突變基因突變率由高到低依次為 KRAS突變(14.72%，29/197)、ALK和MET突變均為(8.12%，16/197)、ERBB2(HER-2)突變/擴增(5.58%，11/197)、ROS1(4.57%，9/197)、BRAF突變(3.55%，7/197)、NTPK突變(3.05%，6/197)、RET突變(2.54%，5/197)。同時在這些少見驅(qū)動基因中，發(fā)現(xiàn)典型驅(qū)動基因發(fā)生事件如下：KRAS G12C突變占7.11%(14/197)、EML4-ALK融合占4.06%(8/197)、MET擴增占2.54%(5/197)、BRAF V600E突變和RET融合各占2.03%(4/197)、ROS1融合占1.02%(2/197)、MET-14外顯子跳躍突變占0.51%(1/197)，見圖1。

圖1 197例NSCLC患者驅(qū)動基因突變頻譜

表1 197例NSCLC二代測序下基因檢測結(jié)果

2.2 晚期NSCLC驅(qū)動基因事件與臨床特征之間的關(guān)系晚期NSCLC驅(qū)動基因突變狀態(tài)與病理類型有關(guān)(P=0.002)。在入組的197例患者中，腺癌184例，非腺癌13例(鱗癌12例、肉瘤樣癌1例)，驅(qū)動基因陽性率為：腺癌76.63%(141/184)、非腺癌38.46%(5/13)；而與性別及年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 197例NSCLC患者的臨床特征

2.3 共突變及互斥突變情況發(fā)生事件在這197例晚期NSCLC患者中，所有驅(qū)動基因變異不只單獨出現(xiàn)，還檢測到共突變與互斥突變事件，且全部發(fā)生在肺腺癌中。本研究中肺腺癌存在的經(jīng)典的共突變：EGFR-EGFR共突變、EGFR-TP53共突變、KRAS-TP53共突變及ALK-TP53共突變，分別為9例、41例、8例、1例。在EGFR突變的91例肺腺癌中，EGFR-TP53共突變最常見，發(fā)生率為45.05%(41/91),EGFR-EGFR共突變則占9.89%(9/91)。另外，還存在互斥突變：EGFR-KRAS 2例、ALK-KRAS 1例。

2.4 各驅(qū)動基因分布狀態(tài)及突變豐度的差異性本研究挑選了最近指南中可作為治療靶點的基因變異：EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2(HER-2)、RET、MET及NTRK，借助熱圖更加直觀的展現(xiàn)肺腺癌中上述驅(qū)動基因分布狀態(tài)及突變豐度的差異性，可見不同驅(qū)動基因之間突變豐度有很大差異，同一驅(qū)動基因不同患者之間突變豐度也相差很大，突變豐度高的區(qū)域主要集中分布在EGFR、TP53,詳見圖2。

圖2 肺腺癌中EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2(HER-2)、RET、MET及NTRK驅(qū)動基因分布狀態(tài)及突變豐度的差異性

3 討論

研究納入的197例NSCLC患者中，主要檢測研究了9個靶向基因(包括EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2(HER-2)、RET、MET及NTRK)的突變狀態(tài)分布及與臨床特征的關(guān)系，數(shù)據(jù)顯示，大約有74%(74.11%)的患者至少有1種驅(qū)動基因突變陽性，少數(shù)患者出現(xiàn)了共突變或互斥突變。最常見的突變是EGFR，大約一半(48.22%)的患者檢出，其次是KRAS、ALK等，與既往報道一致[6]。EGFR、KRAS突變的發(fā)生率因種族而異，EGFR突變在亞洲人患者中更為常見，而KRAS突變在白種人中更為常見。白種人中EGFR只有10%-15%的突變率，相反，最常見的致癌驅(qū)動基因突變?yōu)镵RAS突變(30%)[2,7]，在臨床實踐及臨床研究中需要注意到這種差異。KRAS是繼EGFR突變后的第二大突變位點，本研究中KRAS突變發(fā)生率占14.72%(29/197)，KRAS突變陽性的29例患者中近一半為KRAS G12C突變(14/29)，KRAS G12C是主要的突變類型，與一項來自韓國的研究報道一致[8]。隨著G12C突變位點的藥物研發(fā)突破，KRAS也成為了可用藥靶點。ALK作為繼EGFR之外研究最為久遠的經(jīng)典靶標，EML4-ALK是ALK融合的主要類型(4.2%)，并且均為腺癌患者[9]，本研究中EML4-ALK融合占4.06%。與ALK基因位點相近，ROS1基因融合在NSCLC中的發(fā)生率較低，但對于靶向治療具有非常好的療效。本組中ROS1融合陽性率為1.02%。此外，不同研究可能會因為檢測方法和檢測樣本的不同導致檢測結(jié)果存在一定的差異。本研究樣本量較少，需要進一步擴大樣本量加以證實。

目前的肺腺癌分子分型及靶向治療主要基于單驅(qū)動基因改變，隨著測序研究的深入，一些基因突變之間有很高的共發(fā)生率，定義為共突變；而另一些基因突變之間則很少甚至從不一起出現(xiàn)，定義為互斥突變。共同發(fā)生的基因組改變，特別是在腫瘤抑制基因如TP53和STK11中，已經(jīng)成為致癌基因驅(qū)動的肺癌亞群的分子和臨床異質(zhì)性的核心決定因素[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)了多例基因共突變的患者，EGFR-EGFR、EGFR-TP53、KRAS-TP53及ALK-TP53。在EGFR突變的91例肺腺癌中，EGFR-TP53共突變最常見，發(fā)生率為45.05%(41/91)。KIM等人的研究[8]中發(fā)現(xiàn)TP53是最常見的突變基因(46.9%)，與之報道相符。且有研究報道[11-13]EGFR 突變型肺癌的共突變表達譜具有預后及預測意義，EGFR-TP53 共突變與 TKI 療效相關(guān),并發(fā)現(xiàn)TP53突變是一個獨立的不良預后因素。TP53是一種重要的腫瘤抑制基因，也是大多數(shù)癌癥中最常見的突變基因，這一點已被公認。另外，既往報道[14-15]認為EGFR、ALK與KRAS為互斥突變，即EGFR、ALK和KRAS突變在NSCLC中是相互排斥的，盡管在包括中國在內(nèi)的一些亞洲人中，已經(jīng)報道了一些EGFR、ALK和KRAS突變共同存在的病例[16-18]，且都提示預后不佳。HU等人進行的一項研究中得出結(jié)論：存在共突變的患者較單一EGFR突變患者的無進展生存期(PFS)明顯縮短(6.0個月 vs 10.9個月，P=0.002)，然而對總生存期(OS)沒有顯著影響(17.6個月 vs 21.0個月，P=0.17)[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)EGFR-KRAS 2例、ALK-KRAS 1例，相關(guān)預后問題還待進一步研究。

近年來，隨著基因檢測技術(shù)的進步，越來越多的致癌驅(qū)動基因被發(fā)現(xiàn)，推動了NSCLC靶向藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用，但是靶向耐藥問題不可避免，傳統(tǒng)檢測方法已不能滿足目前的臨床需求，全面的腫瘤分子測序方法成為剛需。目前國內(nèi)外已發(fā)表多個NGS檢測技術(shù)指南，2020年中國肺癌雜志發(fā)布的《二代測序技術(shù)在NSCLC中的臨床應(yīng)用中國專家共識(2020版)》[20]旨在為我國NSCLC臨床診療規(guī)范提供了技術(shù)指引。此外，在常規(guī)的NSCLC患者分子譜分析中應(yīng)用NGS技術(shù)的可行性和成本效益已在研究中[21]證實，可節(jié)省相當?shù)闹苻D(zhuǎn)時間和檢測成本，并可檢測具有潛在預后和預測意義的共突變。在肺癌精準治療的時代，NGS將發(fā)揮越來越重要的作用。