Calreticulin、VRK1、Fbxw7在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及診斷價值研究

張 琳,陳 晨,于藝冰,李一鳴,宋 輝,李峰敏

(秦皇島市第一醫院 血液科,河北 秦皇島066000)

淋巴造血系統惡性腫瘤是最常見的淋巴瘤，發病率逐年升高，在惡性腫瘤死亡原因中居第10位，其中B細胞型非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)發病占淋巴瘤的90%以上，而NHL中最常見的亞型為彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)[1-2]。中國的DLBCL發病率占所有B細胞NHL的40%以上，是成人最常見的B細胞NHL。DLBCL分為生發中心B細胞樣(germinal center B-cell，GCB)型和非生發中心B細胞樣(non-GCB)型[3]。鈣網蛋白(Calreticulin)是內質網主要的鈣結合蛋白之一，主要分布在細胞質及細胞膜中，參與多個重要的細胞過程，主要包括鈣離子平衡調節、基因表達調控、血管生成、細胞黏附、抗原呈遞、自身免疫等[4]。牛痘相關激酶1(vaccinia-related kinase1，VRK1)是絲氨酸-蘇氨酸激酶VRK家族中的一員，參與細胞分裂、轉錄激活、DNA修復和組蛋白修飾等[5]。F框/WD40域蛋白7(F-box and WD-40domain protein7,FBXW7)是一種腫瘤抑制因子，控制細胞的增殖、分化、細胞周期進程、凋亡、癌變等多種細胞生物學過程[6]。目前臨床中缺乏Calreticulin、VRK1、FBXW7聯合檢測彌漫大B細胞淋巴瘤的相關研究，本文旨在研究上述因子在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中的表達及診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年3月到2021年3月在秦皇島市第一醫院病理科保存的60例DLBCL組織以及癌旁組織；根據發病部位分為頸部淋巴結、腹腔淋巴結、腹股溝淋巴結、腋窩淋巴結、鎖骨上淋巴結、縱隔淋巴結。選取同時期在我院病理科保存的正常淋巴組織60例為正常組，兩組研究對象基線資料見表1。

納入標準：(1)符合《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷與治療指南(2013年版)》[7]診斷標準；(2)本文研究患者及其家屬均知情，簽署知情同意書，經過我院倫理委員會批準。

排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)精神異常患者；(3)妊娠期、哺乳期患者；(4)進行漫大B細胞淋巴瘤手術前接受放射治療、化學治療以及生物學療法者。

1.2 指標檢測

1.2.1采用熒光定量RT-PCR檢測Calreticulin、Fbxw7 使用傳統的規范Trizol提取方法提取RNA用beckman酶標儀測定Calreticulin、Fbxw7(1)將彌漫大B細胞淋巴瘤組織放入勻漿管中，加入RNA裂解液，用組織勻漿機破碎組織；(2)加入稀釋液，混勻，室溫放置5-6 min；再加入無水乙醇，混勻，離心10 000 g，半徑15 000 r，7 min，棄濾液；(3)反復3次離心、半徑、棄濾液，將得到的RNA保存在-80℃；(4)按照Takara反轉錄試劑盒進行總RNA的反轉錄；(5)按照Roche LightCycler?480實時定量PCR儀要求；(6)將PCR96孔板4 000 g離心5 min后放入Roche LightCycler?480儀器中，95℃ 5 min為一個循環，95℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 10 s為45循環，95℃ 5 s、65℃ 1 min、97℃、40℃ 30 s為一個循環利用公式-△△ct=(實驗組目的基因ct值-實驗組內參基因ct值)-(對照組目的基因ct值-對照組內參基因ct值)；(7)加入約30 μl DEPC處理的去離子水重新溶解白色沉淀物，即總RNA。

1.2.2采用免疫組織化學法檢測組織中VRK1表達 按抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶(Streptavidin Peroxidase，SP)免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)說明進行操作。(1)取彌漫大B細胞淋巴瘤組織和瘤旁組織石蠟標本，將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇再水合；(2)用配制好的修復液(0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，pH值6.0)PBS沖洗3次,高溫高壓下進行抗原修復15 min,然后用5%過氧化氯處理，阻斷內源性過氧化物酶；(3)滴加稀釋好的正常山羊血清封閉抗原。將切片與兔抗人VRK1單抗(稀釋比1∶100)在5℃下反應過夜，添加山羊抗兔二抗在37℃下反應30 min，然后用過氧化酶標記的鏈酶卵白素工作液室溫反應30 min，二氨基聯苯胺顯色液顯色，顯微鏡下控制顯色時間，Harris蘇木精對比染色，最后進行脫水與封固；(4)在顯微鏡下觀察到在細胞質或細胞核中有棕黃色或棕褐色顆粒即為陽性細胞，高倍鏡下觀察染色強度并計算陽性細胞，計算陽性細胞比例。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 研究對象基線資料比較

如表1所示，DLBCL組、正常組年齡、性別、BMI、比較無統計差異(P>0.05)，具有可比性。

表1 基線資料比較

2.2 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中的比較

如表2所示，彌漫大B細胞淋巴瘤組織Calreticulin、VRK1表達高于瘤旁組織、正常組織，Fbxw7表達低于瘤旁組織、正常組織(P<0.05)。瘤旁組織Calreticulin、VRK1表達高于正常組織，Fbxw7表達低于正常組織(P<0.05)。

表2 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中的比較

2.3 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達在彌漫大B細胞淋巴瘤患者病理特征關系

如Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達與彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期、分化程度、結外病灶個數、LDH、淋巴轉移有關。隨臨床分期程度加重、分化程度越低、結外病灶個數增加、LDH升高，Calreticulin、VRK1表達不斷升高，Fbxw7不斷降低(P<0.05)；有淋巴結轉移患者Calreticulin、VRK1表達量高于無淋巴結轉移者，Fbxw7低于無淋巴結轉移者(P<0.05)。

表3 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達在彌漫大B細胞淋巴瘤患者病理特征關系

2.4 Calreticulin、VRK1、Fbxw7對彌漫大B細胞淋巴瘤的診斷價值

ROC分析Calreticulin、VRK1、Fbxw7單獨預測彌漫大B細胞淋巴瘤的曲線下面積(area under the curve，AUC)低于3項聯合，具有統計學差異(P<0.05)。3項聯合檢測靈敏度、準確度高于Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達單一檢測(P<0.05)，見表4，圖1。

表4 Calreticulin、VRK1、Fbxw7對彌漫大B細胞淋巴瘤的診斷價值

圖1 Calreticulin、VRK1、Fbxw7對彌漫大B細胞淋巴瘤的診斷價值(ROC曲線)

3 討論

DLBCL的發生發展與多種遺傳信息異常有關，是一個異質性、多步驟的過程，由各種信號通路的異常激活或阻滯引起的異常細胞生長、分化、凋亡均會引發DLBCL[8]。現已明確藥物化療的主要機制是誘導癌細胞凋亡，但最終會引起細胞異常增殖、凋亡受到抑制，進而對化療產生耐受性[9-10]。

Araki M研究表明[11]，Calreticulin在多種惡性腫瘤中均有表達，如胃腺癌、尿路上皮癌、鱗狀細胞癌、肺腺癌、前列腺癌等，在腫瘤中發揮促瘤生長、轉移及侵襲等作用,但其在淋巴瘤中尤其是B細胞NHL中表達的臨床意義仍不明確。本文研究結果顯示Calreticulin在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中高于瘤旁組織和正常組織，其水平的高低與患者的臨床分期、分化程度、淋巴轉移有關、結外病灶個數、LDH有關，提示Calreticulin可作為彌漫大B細胞淋巴瘤患者的早期診斷輔助標志物。Liu P研究發現[12]Calreticulin在多種惡性腫瘤中的表達增加，且與腫瘤侵襲、淋巴結轉移等呈正相關。其原因歸結為：Calreticulin是高度保守、普遍存在于哺乳動物細胞內質網腔中的鈣結合蛋白，不僅局限在內質網腔，而是涉及參與調節細胞凋亡、應激、鈣離子平衡調節等多種生理和病理過程的多功能基因[13-14]。

有研究發現[15-16]VRK1在不同腫瘤中存在差異表達，對腫瘤的發展具有調控作用，如VRK1在膠質瘤、乳腺癌、肝細胞癌、食管鱗狀細胞癌、肺癌中發生突變或差異表達，且調控腫瘤的發生。本文研究結果顯示VRK1在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中高表達，隨臨床分期程度加重、分化程度越低、結外病灶個數增加、LDH升高VRK1表達不斷升高。Ben等[17]研究發現VRK1在神經膠質瘤組織和細胞系中高表達，VRK1的表達與神經膠質瘤的病理分級呈正相關。與本文研究結果保持一致。

FBXW7基因是人類重要的抑癌基因，它與腫瘤的發生、發展有著密切的聯系，FBXW7的缺失與腫瘤化療過程中的抵抗也有一定關系[18]。有研究證明[19]FBXW7的腫瘤抑制功能可以由多個監管機構、突變、剪接以及上游的細胞信號通路所調控，主要是通過對下游底物的影響導致腫瘤的發生，故恢復其腫瘤抑制功能也是設計治療癌癥患者的新思路。本研究經ROC分析顯示FBXW7對彌漫大B細胞淋巴瘤診斷價值的AUC達0.711，靈敏度和特異度分別為0.596%、0.825%，提示FBXW7可作為彌漫大B細胞淋巴瘤患者的早期診斷輔助標志物。有研究發現[20]FBXW7在腫瘤中抑制蛋白，在多種惡性腫瘤中低表達，包括急性T淋巴細胞白血病、胃結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、膽管上皮癌、胰腺癌、食管鱗狀細胞癌等，這與本文研究結果一致。

綜上所述，Calreticulin、VRK1、FBXW7在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中表達異常，其表達水平的高低與臨床分期、分化程度、淋巴轉移有關、結外病灶個數、LDH升高有關，三者聯合對彌漫大B細胞淋巴瘤患者的診斷價值顯著。

作者簡介：張琳(1986-)，女，主治醫師，研究生學歷，主要從事血液科常見病的臨床和科研工作。