miR-146a/b 在慢性阻塞性肺疾病患者血清中的表達(dá)及相關(guān)性分析

葛 飛，孟凡亮

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 合肥 238000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種與老齡化和吸煙相關(guān)的氣流不可逆受限為特征的疾病，到2030年，慢性阻塞性肺疾病將成為全球第3 大死因，目前發(fā)展中國(guó)家患病率仍在上升[1]。近年來(lái)，由于其高死亡率和致命的共病[2]，引起了越來(lái)越多的關(guān)注，且慢性阻塞性肺病在老年人中診斷過(guò)度，在成人中診斷不足，因此需要尋找一種有效診斷慢性阻塞性肺疾病的方法。微小核糖核酸（miRNAs）是一個(gè)不斷增長(zhǎng)的小非編碼核糖核酸家族，通過(guò)與靶向信使核糖核酸（mRNAs）的3 非翻譯區(qū)（3UTR）結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。通過(guò)改變miRNAs 的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)[4]，如增殖、凋亡、分化，其與腎臟疾病、心血管功能障礙、肺部疾病和癌癥等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[5-8]。慢性阻塞性肺疾病與有毒氣體或香煙煙霧的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)[9]，降鈣素原（PCT）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、血沉（ESR）可準(zhǔn)確反映慢阻肺患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，是了解患者病情變化的主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[10]。因此，本研究分析了三組miR-146a/b 相對(duì)表達(dá)量的差異，及其與上述指標(biāo)的相關(guān)性，評(píng)價(jià)其臨床價(jià)值與意義，旨在為該病的診斷提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1 月-11 月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院急性加重期慢阻肺（AECOPD）患者90例，穩(wěn)定期慢阻肺（stable COPD）患者90例。另選取在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院進(jìn)行健康體檢，且年齡、性別與全部慢阻肺患者相匹配的健康體檢者90例設(shè)為對(duì)照組。按照2020年慢性阻塞性肺疾病GOLD 指南，把急性加重期組分為GOLD2 級(jí)6例，GOLD3 級(jí)69例，GOLD4 級(jí)15例；穩(wěn)定期組分為GOLD2 級(jí)21例，GOLD3 級(jí)66例，GOLD4 級(jí)3例。急性加重期組男64例，女26例；年齡（74.87±8.09）歲；BMI（23.36±3.04）kg/m2。穩(wěn)定期組男67例，女23例；年齡（75.40±8.16）歲；BMI（22.46±2.97）kg/m2。對(duì)照組男65例，女25例；年齡（74.06±7.82）歲；BMI（23.05±2.93）kg/m2。三組年齡、性別及BMI 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象知情同意并簽署同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 急性加重期組 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞50歲；②根據(jù)全球慢性阻塞性肺疾病倡議標(biāo)準(zhǔn)診斷為慢性阻塞性肺疾病；③至少連續(xù)2 d 出現(xiàn)至少2 種以下主要癥狀（呼吸困難增加、痰膿增加、痰量增加）或1 種主要和1 種次要癥狀（流涕/充血、喘息、喉嚨痛、咳嗽）的急性加重。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)哮喘、肺癌或其他相關(guān)肺部疾病；嚴(yán)重感染、腫瘤、自身免疫性疾病的病史。

1.2.2 穩(wěn)定期組 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞50歲；②根據(jù)金標(biāo)準(zhǔn)診斷為慢性阻塞性肺病；③在過(guò)去的6個(gè)月無(wú)急性惡化。排除標(biāo)準(zhǔn)與急性加重期組相同。

1.2.3 對(duì)照組 排除患有感染、肺病、腎功能或肝功能障礙以及嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、自身免疫性疾病史。

1.3 標(biāo)本采集 慢阻肺急性加重期患者入院第1 天、穩(wěn)定期慢阻肺患者和健康者體檢采集外周血。室溫靜置1 h 后，外周血在4 ℃下以3000 r/min 條件下離心15 min，獲得上清液，裝于的EP 管中，置于-80 ℃冰箱保存，集中進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 miR-146a/b 的檢測(cè)方法

1.4.1 miRNA 的提取 采用北京天根生化科技有限公司miRcute 血清/血漿miRNA 提取分離試劑盒DP503 提取研究對(duì)象的血清標(biāo)本總miRNA，將獲得的miRNA 溶液置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 采用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)定量試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4.3 實(shí)時(shí)定量PCR 法 采用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)定量試劑盒，熒光定量PCR（Q-PCR）實(shí)驗(yàn)染料法。miR-146a、miR-146b 以U6 為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參。采用2-△△Ct 算法計(jì)算miR-146a、miR-146b 相對(duì)表達(dá)量。其中△△Ct=（Ct 實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct 實(shí)驗(yàn)組U6）-（Ct 對(duì)照組目的基因-Ct 對(duì)照組U6），qRT-PCR 引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.5 血清炎癥標(biāo)志物和肺功能指標(biāo)的檢測(cè)方法

1.5.1 血清炎癥標(biāo)志物（PCT、CRP 及ESR）表達(dá)水平的檢測(cè)方法 研究對(duì)象均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血液5 ml，采用免疫散射速率比濁法測(cè)定超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）表達(dá)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定PCT；采用魏氏法測(cè)定ESR 表達(dá)水平。

1.5.2 肺功能指標(biāo)的檢測(cè)方法 所有研究對(duì)象均通過(guò)肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)其肺功能包括1 秒用力呼氣量（FEV1）、1 秒用力呼氣量/用力肺活量（FEV1/FVC）和最大呼氣流量（PEF）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料使用（n）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以（）表示，比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，miR-146a/b 相對(duì)表達(dá)量與GOLD 分期比較運(yùn)用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，與炎癥標(biāo)志物和肺功能指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系使用Pearson 相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組肺功能指標(biāo)比較 急性加重期組和穩(wěn)定期組的FEV1、FEV1預(yù)測(cè)值、FEV1/FVC 均低于對(duì)照組，且穩(wěn)定期組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 三組肺功能指標(biāo)比較（）

表2 三組肺功能指標(biāo)比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與穩(wěn)定期組比較，bP＜0.05

2.2 三組血清炎性標(biāo)志物比較 急性加重期組血清PCT、CRP 及ESR 表達(dá)水平均高于穩(wěn)定期組和對(duì)照組（P＜0.05）。穩(wěn)定期組PCT、CRP 及ESR 表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 三組血清炎性標(biāo)志物比較（）

表3 三組血清炎性標(biāo)志物比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與穩(wěn)定期組比較，bP＜0.05

2.3 三組miR-146a/b 比較 急性加重期組血清中的miR-146a 水平低于穩(wěn)定期組和對(duì)照組（P＜0.05）；穩(wěn)定期組和對(duì)照組血清中miR-146a 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；急性加重期組血清中的miR-146b 水平低于穩(wěn)定期組和對(duì)照組（P＜0.05）；穩(wěn)定期組和對(duì)照組血清中miR-146b 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 三組miR-146a/b 比較（）

表4 三組miR-146a/b 比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05，cP＞0.05；與穩(wěn)定期組比較，bP＜0.05

2.4 miR-146a/b 相對(duì)表達(dá)量與GOLD 分期的關(guān)系急性加重期組各GOLD 分期miR-146a/b 的表達(dá)量分布不全相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1A、圖1B；穩(wěn)定期組中GOLD 分期miR-146a/b 的表達(dá)量分布不全相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1C、圖1D。

圖1 miR-146a/b 相對(duì)表達(dá)量與GOLD 分期的關(guān)系

2.5 miR-146a/b 的水平與血清炎性標(biāo)志物和肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 急性加重期組和穩(wěn)定期組血清中miR-146a/b 水平與PCT、CRP 及ESR 均呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系，與FEV1、FEV1預(yù)測(cè)值、FEV1/FVC 均呈正相性關(guān)系，見(jiàn)表5、表6。

表5 急性加重期組miR-146a/b 表達(dá)量與各指標(biāo)的相關(guān)性（r）

表6 穩(wěn)定期組miR-146a/b 表達(dá)量與各指標(biāo)的相關(guān)性（r）

3 討論

慢性阻塞性肺疾病是一個(gè)重大的全球性健康問(wèn)題，與慢性氣道和肺實(shí)質(zhì)炎癥有關(guān)[11]。20%的急性加重期慢性阻塞性肺疾病病例是由非感染因素引起的，而大多數(shù)慢性阻塞性肺疾病急性加重是由感染引起的。慢性阻塞性肺疾病患者的急性加重會(huì)增加氣道炎癥，增加炎癥因子的合成，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，并導(dǎo)致體內(nèi)炎癥增加，所以感染是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病的最關(guān)鍵因素[10，12，13]。目前臨床上以患者有慢性咳嗽、咳痰、進(jìn)行性加重的呼吸困難及有慢性阻塞性肺疾病危險(xiǎn)因素的接觸史時(shí)，考慮慢性阻塞性肺疾病。肺功能檢查能明確診斷氣道的不可逆氣流受限；但并沒(méi)有新的、有效的生物標(biāo)志物來(lái)診斷慢性阻塞性肺疾病。

MiR-146a 和miR-146b 屬于miR-146 家族[8]。MicroRNAs（miRNAs）是一個(gè)19～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA 家族，其在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，具有重要的生物學(xué)功能[3，14]。慢性阻塞性肺疾病的加重可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)的加劇，從而導(dǎo)致血液循環(huán)中感染指標(biāo)的變化。ESR、CRP、PCT 是提示感染的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，可反映患者炎癥反應(yīng)的水平[3，14]。

本研究結(jié)果顯示，急性加重期組血清炎性標(biāo)志物和肺功能指標(biāo)均高于穩(wěn)定期組和對(duì)照組，說(shuō)明急性加重期慢性阻塞性肺疾病比穩(wěn)定期有更明顯的炎癥反應(yīng)和肺功能下降。

近些年有研究表明[16-18]，miR-146a 下調(diào)白細(xì)胞介素1 受體（IL-1R）和Toll 樣受體（TLR）信號(hào)成分IL-1 受體相關(guān)激酶（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF6），對(duì)IL-1β、IL-6 和IL-8 等炎癥因子有著負(fù)反饋調(diào)節(jié)的能力。miR-146b-5p 在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）通過(guò)靶向IRAK1，抑制核因子κB（NF-κB）活性和NF-kB 相關(guān)IL-6、IL-8 的產(chǎn)生，且miR-146b-5p 與IRAK1 呈負(fù)相關(guān)；IRAK1 是IL-1R/TLR 信號(hào)通路中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與NF-κB 調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)、抗凋亡和腫瘤進(jìn)展[19，20]，說(shuō)明miR-146a/b 可能通過(guò)與靶mRNAs 的3UTR 相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解，或者兩者兼有。另有研究證實(shí)，在未成熟樹突狀細(xì)胞（imdc）和成熟樹突狀細(xì)胞（mDCs）中過(guò)表達(dá)miR-146a 和/或miR-146b 則增加DC 凋亡，ImDC和MDCS 中miR-146a 和miR-146b 的表達(dá)與TRAF6 和IRAK1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，TRAF6 和（或）IRAK1 的siRNA 沉默促進(jìn)了DC 的凋亡。沉默miR-146a 和miR146b 可通過(guò)IL-12p70 介導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞活化增加IL-12p70、IL-6 和TNF-γ 的產(chǎn)生以及IFN-γ 的產(chǎn)生，而mDCs 中miR-146a 和miR-146b 的過(guò)表達(dá)則減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在樹突狀細(xì)胞中miR-146a 和miR-146b 還可以下調(diào)NF-κB[3]。因此推測(cè)出一種負(fù)反饋機(jī)制，即miR-146a/b-TRAF6/IRAK1-NF-kB 軸調(diào)節(jié)人樹突狀細(xì)胞凋亡和細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，說(shuō)明miR-146a/b 是一種抗炎miRNA。本研究結(jié)果顯示，在急性加重期組和穩(wěn)定期組中miR-146a/b的相對(duì)表達(dá)量與血清炎性標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，與肺功能呈正相關(guān)；并且急性加重期組的miR-146a/b 的相對(duì)表達(dá)量低于穩(wěn)定期組，進(jìn)而推測(cè)出miR-146a/b在炎癥激活的調(diào)節(jié)中都起著關(guān)鍵作用，在慢性阻塞性肺疾病中miR-146a/b 低表達(dá)減少對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制，抗炎作用減弱，導(dǎo)致炎癥因子的大量分泌，增加了炎癥反應(yīng)，進(jìn)而破壞肺泡細(xì)胞使肺功能進(jìn)一步下降，使病情更加惡化。因此，miR-146a/b 的相對(duì)表達(dá)量可能診斷出急性加重期慢性阻塞性肺疾病，而穩(wěn)定期組與對(duì)照組的miR-146a/b 的相對(duì)表達(dá)量相似，所以不能通過(guò)miR-146a/b 來(lái)診斷穩(wěn)定期的慢性阻塞性肺疾病。

綜上所述，miR-146a/b 在急性加重期慢性阻塞性肺疾病患者的血清中低表達(dá)，與炎癥反應(yīng)水平呈負(fù)相關(guān)，與肺功能指標(biāo)呈正相關(guān)，miR-146a/b 有望成為輔助急性加重期慢性阻塞性肺疾病早期診斷的重要生物分子標(biāo)志物，對(duì)急性加重期慢性阻塞性肺疾病的早期診斷和預(yù)后具有重要價(jià)值。本研究尚存不足之處，包括樣本量不足及尚未研究miR-146a/b 在肺組織中的表達(dá)情況等，仍需要深入研究。