基于網絡藥理學探討金錢草治療腎結石的作用機制

王亞婷，劉 昱，李明權

（1.成都中醫藥大學臨床醫學院，四川 成都 610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院腎病二科，四川 成都 610075）

腎結石（nephrolithiasis）是晶體物質（如鈣、草酸、尿酸、胱氨酸等）在腎臟的異常聚集所致，是泌尿系統的常見病、多發病。該病主要臨床表現為活動后劇烈腰痛、血尿、尿急、尿痛。有研究表明[1]，我國泌尿系結石的發病率為1%～5%，南方地區高達5%～10%。目前，腎結石的主要治療方式包括：①經皮腎鏡碎石取石術；②體外震波碎石術（ESWL）；③腎實質切開手術；④服用解痙、抗炎藥物[2]。雖然上述治療方法效果良好，但患者術后結石殘留率及復發率仍居高不下[3]。近年來，關于中醫藥治療腎結石的研究報道越來越多，證實了金錢草治療腎結石具有良好的效果[4]。金錢草，味甘、咸，微寒，歸肝、膽、腎、膀胱經，具有利尿通淋、利濕退黃、解毒消腫之功效[5]。臨床上可用于治療濕熱黃疸、膽脹脅痛、石淋、熱淋、小便澀痛、癰腫疔瘡、蛇蟲咬傷等疾病[6]。現代研究表明[7]，金錢草可發揮利尿、抑制草酸鈣形成、降低血清尿酸水平、抗炎鎮痛、抗氧化、腎臟保護等作用來治療腎結石，具有很好的臨床療效。雖然金錢草治療腎結石具有良好的效果，但因中藥多成分、多靶點和多途徑的特點，金錢草的藥效物質基礎及作用機制尚未明確。網絡藥理學是以系統生物學和多向藥理學等多學科理論為基礎，從多維度視角理解藥物干預疾病的分子機制。大量研究表明，通過網絡藥理學研究中藥的作用機制準確可靠。為此，本研究以金錢草10個成分為基礎，運用網絡藥理學方法構建藥物-活性成分-疾病-靶點網絡，并進行網絡拓撲學分析，探討其多成分、多靶點、多通路的作用機制，旨在為金錢草治療腎結石作用機制的深入研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 化學成分的收集 利用TCMSP 數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php），獲取金錢草的化學成分。通過口服生物利用度（OB）和類藥性（DL），篩選出同時滿足OB≥30%，DL≥0.18 的化學成分。

1.2 預測潛在靶點 通過TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數據庫篩選出化學成分的靶標蛋白，使用Perl 語言并結合Uniprot 數據庫，得到金錢草的靶點基因。在OMIM（http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫中輸入關鍵詞“kidney stone”搜索已報道與腎結石相關的基因，并去除重復靶點。然后把所得疾病靶點與金錢草靶點基因使用R 語言程序進行對比，以此篩選出共同的靶點，繪制韋恩圖。

1.3 網絡模型的構建 通過將金錢草和腎結石共同作用的靶點導入String 數據庫（https://string-db.org），限定物種為人，進行蛋白互作用分析（PPI）。為確保數據的可靠性，選取high score＞0.9 的高置信度，保存結果。

1.4 基因本體（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 首先，對上述所得的靶點進行ID 轉換，使用R 語言將金錢草與腎結石的共作靶點轉換成entrezID；其次，在R 語言中調用生物類的程序包，如clusterProfiler，bioconductor 等進行數據的處理；然后，運行R 語言得到GO 和KEGG 富集分析的條形圖、氣泡圖、通路圖及包含P值的結果，如果是圖形則設置只顯示P值最小的前20個；最后，使用Perl 將轉換的entrez ID 變成原始基因靶點。

2 結果

2.1 活性成分的篩選 在TCMSP 數據庫中，根據OB、DL值篩選到符合條件的10 種化學成分，見表1。

表1 金錢草的10 種化學成分

2.2 作用靶點的預測 將TCMSP、Swisstargetprediction 數據庫得到的所有靶點，刪除重復并去除假陽性，整合得到金錢草活性成分作用靶點331個；疾病靶點與金錢草靶點基因對比，篩選出二者共同靶點82個，繪制韋恩圖見圖1。

圖1 作用靶點

2.3 網絡藥理可視化 通過Cytoscape 3.7.1 軟件將金錢草10個活性成分與82個金錢草治療腎結石的靶點相連，繪制出金錢草的“藥物-活性成分-疾病-靶點”相互作用的網絡圖，見圖2。

圖2 藥物-活性成分-疾病-靶點網絡圖

2.4 金錢草與腎結石蛋白質相互作用網絡的構建將篩選到的靶點輸入String 數據庫中，限定物種為人，共涉及82個節點，188 條邊。其中排名前5 的蛋白包括HSP90AA1（20）、EGFR（15）、CCND1（13）、ESR1（13）和RELA（13），見圖3、圖4。

圖3 金錢草-腎結石蛋白質相互作用網絡

圖4 PPI 中的核心基因

2.5 GO 功能富集分析 將藥物和疾病共同作用的82個靶點經R 語言進行GO 功能富集分析，前20個功能的GO 功能富集分析見圖5，其涉及NFkappaB 結合、熱休克蛋白結合、核受體活性、轉錄因子活性，直接的配體調節序列特異性DNA 結合、類固醇結合、組蛋白激酶活性等生物學過程。

圖5 金錢草治療腎結石候選靶點的GO 富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 將所得的82個共作靶點使用R 語言程序進行KEGG 通路富集分析，運行后得到119 條通路，見圖6。結果顯示，金錢草治療腎結石除了涉及Prostate cancer、Fluid shear stress and atherosclerosis 等顯著性較高的通路，還涉及了Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Apoptosis、Proteoglycans in cancer、TNF signaling pathway、p53 signaling pathway、MicroRNAs in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、Bladder cancer、Human cytomegalovirus infection、Colorectal cancer、Measles、small cell lung cancer、Human immunodeficiency virus 1 infection、MAPK signaling pathway、Endocrine resistance、Hepatitis C 及Pancreatic cancer等18 條具有顯著性的通路。

圖6 金錢草-腎結石潛在靶點KEGG 通路富集分析

3 討論

本研究結果顯示，通過TCMSP 數據庫共篩選出OB≥30%和DL≥0.18 的金錢草候選成分10個。將金錢草靶點與腎結石靶點取交集，得到藥物-疾病共作靶點82個。在金錢草的藥物-活性成分-疾病-靶點網絡圖中清晰可見相同成分作用于多靶點，每1個靶點也可對應多個成分，充分體現了中藥多成分、多靶點的特點。與此同時，活性成分中度值最高的包括槲皮素、山柰酚和金合歡素，這些成分均對腎臟疾病具有治療作用。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，除具有抗氧化和抗腫瘤等作用外，還能夠減少細胞凋亡、緩解炎癥反應[8]。有研究顯示[9]，槲皮素通過作用于緊密連接蛋白（claudins），導致上皮屏障更緊密，可能會減少鈉、鈣和水的重吸收，從而防止腎結石的形成。山柰酚存在于多種中藥之中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。研究發現[10]，山柰酚在糖尿病腎病中能夠有效提高AGE 誘導的腎小球系膜細胞中的超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量，抑制活性氧生成并防止氧化應激等，為未來治療糖尿病腎病提供了新的思路。金合歡素是一種天然樹膠衍生物，具有抗炎、抗氧化作用。研究證實[11]，金合歡素對動物和人類的腎臟均具有保護作用。本次研究中靶點中度值最高的為CYP1B1、ALOX5、ESR2。CYP1B1 屬于細胞色素P450 超家族，參與了多種化合物代謝（包括致癌物）。既往研究表明[12]，CYP1B1可能通過誘導CDC20 表達并通過下調DAPK1 抑制細胞凋亡來促進腎細胞癌的發展，為腎細胞癌的治療提供了新的方向。ALOX5 是由巨噬細胞產生，能夠催化花生四烯酸向白三烯A4 轉化的限速酶，在單側輸尿管梗阻（UUO），葉酸腎病和直系同源小鼠多囊性腎臟疾病模型中被強烈誘導，而抑制ALOX5通路可抑制單側輸尿管梗阻、葉酸腎病患者的腎臟纖維化[13]。草酸是導致腎結石發病的重要物質。據報道[14]，ESR2 信號可通過乙醛酸氨基轉移酶（AGT1）表達的轉錄上調抑制草酸的生物合成，進而抑制草酸鹽誘導的氧化應激。據此，推測槲皮素、山柰酚、金合歡素可能作用于CYP1B1、ALOX5、ESR2 等關鍵靶點，在金錢草的藥理中發揮重要作用。

基于STRING 數據庫構建靶點交互作用網絡，分析得到HSP90AA1（20）、EGFR（15）、ESR1（13）、RELA（13）等治療腎結石的核心靶點。它們是參與腎結石的病理過程，也是金錢草治療腎結石的關鍵靶點所在。HSP90AA1 是HSP90 的一種亞型。HSP90是一種普遍表達，高度保守的應激蛋白，能夠與多種蛋白質相互作用并調節其活性。有研究指出[15]，在腎臟內轉染HSP90α 或HSP90β 可以有效防止缺血/再灌注腎損傷。RELA 在調控炎癥的細胞信號系統——NF-κB 信號通路中起著極其重要的作用，而腎結石的發病又與NF-κB 信號通路密切相關[16]。

GO 富集結果表明，金錢草的活性成分靶點會影響NF-κappB 結合、熱休克蛋白結合。NF-κappB是轉錄因子家族通用名稱，能夠調節涉及免疫、炎癥和細胞存活的基因。Lu Y 等[17]通過對建立的miRNA網絡進行分析，提出NF-κappB 可能在尿鈣過多的尿路結石癥中起關鍵作用。有研究表明[18]，熱休克蛋白HSP90 能夠充當腎小管上皮細胞頂膜上一水草酸鈣晶體的潛在受體，參與晶體的內吞/內化作用，從而預防腎結石的形成。此外，金錢草活性成分靶點還可影響核受體活性、轉錄因子活性，直接的配體調節序列特異性DNA 結合、類固醇結合、組蛋白激酶活性等生物學過程。KEGG 通路分析顯示，前列腺癌信號通路為顯著性最高的信號通路。該通路包含了PI3K-Akt、Apoptosis、MAPK、p53 等主要信號通路，其中MAPK 信號通路涉及了細胞增殖、分化、遷移等多種細胞功能。研究表明，草酸鹽是腎結石形成的重要因素。研究發現[19]，草酸鹽和草酸鈣晶體均選擇性激活了p38-MAPK 信號轉導，因此通過抗氧化劑阻斷NF-kB 和p38-MAPK 激活可能是治療和預防尿酸結石的有效策略。p53 激活是由包括DNA 損傷，氧化應激和激活的癌基因等應激信號所誘導的。此外，p53 蛋白還可對細胞周期停滯、細胞衰老或凋亡進行調節。既往研究表明，草酸鹽誘導的體外細胞凋亡增加可能有助于結石形成。Miyazawa K 等[20]對結石大鼠進行觀察發現，大鼠腎臟中p53 基因的mRNA 上調，由此推測，腎結石的發病可能與p53 上調有關。

本研究不足：本實驗的網絡藥理學研究是基于生物信息學及數據庫的計算得出結果，后續將在此基礎上進行進一步篩選和體內外實驗驗證，從而明確金錢草治療腎結石的主要調控靶點。

綜上所述，金錢草中槲皮素、山柰酚、金合歡素等有效成分可能通過影響NF-κB 結合、熱休克蛋白結合、核受體活性、轉錄因子活性，直接的配體調節序列特異性DNA 結合、類固醇結合、組蛋白激酶活性等機制發揮抗腎結石的作用。