SIX1 和SIX4 蛋白在結腸腺瘤性息肉中的表達和意義

薛 梅，魏秀芹，康春博，賈 偉，張夢巧，馬 超，王立偉，高 強

（首都醫科大學附屬北京康復醫院消化科，北京 100144）

結腸癌（colon cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內，其發病率位居所有惡性腫瘤的第4 位[1]。據報道[2]，早期結腸癌5年生存率為95%，中晚期結腸癌5年生存率僅為20%。結腸腺瘤性息肉是結腸癌公認的癌前病變，結腸腺瘤發展成浸潤性癌的年轉化率約為0.25%[3]，因此結腸腺瘤性息肉的早診早治對于改善結腸癌預后至關重要[4]。結腸鏡下息肉切除治療是目前治療結腸腺瘤性息肉的首選方法，但清潔腸道和腸鏡檢查較為痛苦，且麻醉會增加結腸鏡檢查后并發癥發生風險，因此尋找結腸腺瘤性息肉新的預防和治療方法將有效減少結腸癌的發生。同源基因家族（sine oculis homeobox，SIX）由6個成員組成（SIX1、SIX2、SIX3、SIX4、SIX5 和SIX6）[5]，這6個家族成員均有兩個保守的結構域，這些結構域參與蛋白質的相互作用，而同源異形域（homeo-domain，HD）參與DNA 結合[6]。SIXs 參與調控多種細胞功能，包括參與組織和器官的發育等，而其失調也與腫瘤的發生發展有關。本研究主要分析SIX1 和SIX4 在結腸腺瘤性息肉中的表達和意義，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片 采用從上海芯超生物科技有限公司購買的結腸癌/癌旁組織芯片，該芯片手術時間為2019年11 月-2020年5 月，結腸癌組織和癌旁組織各1個點，共30例，其中男21例，女9例，年齡36～73歲，平均年齡66.7歲。收集2019年11 月-2020年5 月首都醫科大學附屬北京康復醫院結腸腺瘤性息肉患者共30例，其中男18例，女12例，年齡33～71歲，平均年齡65.5歲。本研究經醫院倫理委員會審批同意，患者知情同意并簽屬知情同意書。

1.1.2 主要試劑 一抗為兔抗人SIX1 和SIX4 抗體（北京博奧森生物技術有限公司）、小鼠/兔鏈霉卵白素一生物素法檢測系統通用SP 試劑盒SP-9000（北京中杉金橋生物技術有限公司）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、抗原修復液（pH=9.0，20 倍）、PBS（濃度為0.01 mmol/L，pH=7.4）、DAKO 顯色劑（北京安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 SP 免疫組化法染色 參照文獻[7]的免疫組化方法，SIX1 和SIX4 一抗（一抗∶抗體稀釋液=1∶200）稀釋過夜，次日DAKO 顯色后，蘇木素染核、分化、封片，鏡下觀察評分。

1.2.2 結果判定 SIX1 和SIX4 蛋白主要表達于腺體細胞的細胞質及細胞膜，以細胞質及細胞膜出現淡黃色、黃色、棕黃色為陽性。按陽性細胞比例計分：＜10%為0 分，10%～30%為1 分，31%～60%為2 分，＞60%為3 分；按染色強度計分：無色為0 分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分。將兩項計分相乘，乘積≤3 分為SIX4 表達陰性（-），＞3 分為SIX4表達陽性（+）[8]。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件對數據進行處理，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

結腸腺瘤性息肉組織中SIX1、SIX4 蛋白表達低于結腸癌組織，高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1；SIX1、SIX4 蛋白表達在結腸腺瘤性息肉內定位于結腸上皮細胞質及細胞膜，見圖1。

表1 結腸腺瘤性息肉、結腸癌癌組織與癌旁組織中SIX1、SIX4 表達水平比較[n（%）]

圖1 結腸腺瘤性息肉組織、結腸癌組織和癌旁組織中SIX1 和SIX4 的表達（SP×200）

3 討論

大多數結腸癌起源于腺瘤，因此結腸腺瘤性息肉是結腸癌癌前病變。結腸息肉中80%是腺瘤性息肉，其發展由小到大，然后發展為不典型增生，最后成為癌癥，而這個演變為癌的過程至少需要10年[9]。因此，臨床早期預防、診斷和治療結腸腺瘤性息肉對于改善患者預后具有重要意義。目前關于結腸息肉發生癌變的具體機制尚不清楚，臨床發現絨毛狀腺瘤較管狀腺瘤性息肉癌變率高，而炎性及增生性息肉基本不癌變[10]。研究證實[11]，腸道中正常存在的干細胞功能紊亂，如自我更新、克隆增殖、分化和凋亡失去平衡，不但與結腸腺瘤性息肉和結腸癌的發生有直接或者間接的關系，而且很有可能是腫瘤細胞的最早起源。因此，從細胞和分子生物學水平上研究結腸腺瘤性息肉發生規律及原因，對于結腸腺瘤性息肉的早期診斷、結腸癌發生風險預測及尋找新的治療方法和新的靶點具有非常重要的意義。到目前為止，已經發現了一些與腫瘤干細胞相關的表面標志物，SIX 家族蛋白是器官發生的關鍵調節因子，在腫瘤發生、發展中起著關鍵作用[12]。

本研究結果顯示，結腸腺瘤性息肉組織中SIX1蛋白表達低于結腸癌組織，高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），提示SIX1 可能參與結腸腺瘤性息肉癌變的過程。Xu H 等[11]研究發現，SIX1 可以顯著促進大腸癌的生長和轉移。Xia Y 等[12]研究發現，SIX1 參與非小細胞肺癌腫瘤發展過程中的侵襲和增殖。此外，SIX1 在乳腺癌[13]、宮頸癌[14]、肝細胞癌[15]、結直腸癌[16]等多種腫瘤中呈高表達，參與腫瘤的發生和發展，并與患者不良臨床預后密切相關[17-19]。研究表明[20]，SIX1 通過刺激血管生成，促進腫瘤間質的重塑、轉移，是結腸癌患者主要死亡原因。與SIX1相似，結腸腺瘤性息肉組織中SIX4 蛋白表達低于結腸癌組織，高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），表明SIX4 在結腸腺瘤性息肉向結腸癌的轉變過程中發揮作用，與Li G 等[21]研究結果類似。SIX4 含有760個氨基酸，參與器官發育，如肌肉發生和神經發生，而其在腫瘤發生、發展過程中通過將DNA 序列與靶基因結合，既可作為轉錄抑制因子，又可作為轉錄激活因子。

綜上所述，在結腸腺瘤性息肉中SIX1 和SIX4表達低于結腸癌，但高于癌旁正常組織，提示SIX1和SIX4 可能在結腸腺瘤性息肉發生過程中發揮作用。檢測SIX1 和SIX4 蛋白表達可能有助于結腸癌的早期診斷。