中藥有效成分消除G-菌耐藥性研究進展

左麗，曠年玲，鄧聰聰，呂興幫，張博，吳逸琳，張永英

（河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056000）

抗生素作為廣譜抗菌藥物，對治療動物疾病具有重要作用。但過度應用抗生素，使細菌耐藥現象日趨嚴重[1]。革蘭氏陰性菌（G-菌）因其獨特的細胞壁結構導致耐藥現象更為嚴重，主要表現在多重耐藥、耐藥機制復雜等方面，不僅對養殖業造成了巨大損失，也為人類食品安全帶來了巨大隱患。因此，消除細菌耐藥性恢復其對抗菌藥物敏感性成為研究熱點。目前多采用化學合成的抗菌增敏藥物對抗細菌耐藥性，但易產生毒副作用，如十二烷基硫酸鈉（SDS）[2]。中藥來源豐富、毒副作用小、不易產生耐藥性、在消除細菌耐藥方面具有多靶位效應等優點，近年來受到研究者的廣泛關注[2]。但中藥成分復雜，藥效成分和含量受產地、收獲季節、炮制方式等因素影響較大，在動物臨床應用中受到很多限制。而中藥有效成分避免了中草藥的缺點，同時還具有多靶性和無耐藥性等優點[3]，成為消除細菌耐藥性方面的研究熱點。文章對G-菌耐藥性的研究現狀以及耐藥產生機制、中藥有效成分消除G-菌耐藥性的研究現狀和中藥有效成分協同消除G-菌耐藥性研究進展進行綜述，以期為中藥有效成分逆轉G-菌耐藥性提供參考。

1 G-菌耐藥現狀和耐藥產生機制

1.1 G-菌耐藥現狀

G-菌因具有特殊結構的細胞壁更易產生耐藥性。與革蘭氏陽性菌（G+菌）相比，G-菌細胞壁主要有3點不同：

（1）G-菌的肽聚糖層更薄。

（2）肽聚糖層外具有親水性和疏水性雙重特性的外膜雙分子層，包含脂多糖（LPS）分子、磷脂和外膜蛋白（OMPs）[4]。上述動態外膜構成對抗抗生素的屏障，大部分抗菌藥物必須穿過外膜才可具有抗菌作用，其中氯霉素和氨基糖苷類疏水抗生素可利用脂質通道進入胞內，但其他疏水抗生素和極性分子無法進入，可能與LPS作用有關。

（3）G-菌外膜和細胞壁之間存在周質間隙。β-內酰胺類抗生素利用孔蛋白(Porin)等通道蛋白進入細胞周質[5]，但具有胞質靶點的分子因內膜限制而無法進入細胞質[6]，從而無法達到治療效果。因此產生的耐藥性難以消除，G-菌疾病的治療更加復雜[7]。

近年來多重耐藥菌數量急劇增加，馮敏燕等[8]測定2008—2014年山東省不同地區雞場分離的210株大腸桿菌對14種抗生素的耐藥性，發現大腸桿菌對13種抗生素（多西環素除外）的耐藥率有所增長，對其中10種抗生素的耐藥率增長1倍甚至更高。Huber等[9]對2013—2019年加拿大肉雞中沙門氏菌、彎曲桿菌和大腸桿菌的耐藥性進行了調查，發現2014年加拿大實施家禽業減少抗生素使用戰略后，耐藥菌對抗生素的耐藥性下降了6%～38%，表明當某一種高耐藥性的抗生素（如頭孢類抗生素）退出臨床使用后，G-菌逐漸會對另一種抗生素（如氨基糖苷類抗生素）產生耐藥性，形成惡性循環。崔瑩等[10]對河南鄭州生禽肉樣品進行檢測，發現檢出的26株致瀉大腸桿菌耐藥率達96.15%，其中對四環素耐藥率高達84.62%，對5種及以上抗生素耐藥的菌株占68%。Lenart-Boron等[11]從某污水處理廠附近河流分離出50株大腸桿菌，發現該大腸桿菌對阿莫西林耐藥菌株高達90%，氨芐西林耐藥菌株占36%，頭孢菌素耐藥菌株占30%，對3種及以上抗生素耐藥的大腸桿菌占40%。張立偉[12]對河北地區雞源大腸桿菌耐藥性進行檢測，發現56株大腸桿菌中對β-內酰胺類抗生素耐藥的菌株最多，對氨芐西林耐藥的菌株占94.64%，多數菌株對5種及以上的抗生素具有耐藥性。Datok等[13]發現，從尼日利亞某城市出售的300份烤牛肉樣品中分離出的大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率高達100%，其次是阿莫西林/克拉維酸、環丙沙星、呋喃妥因、亞胺培南和頭孢曲松，多重耐藥大腸桿菌占97.5%。上述研究表明，G-菌對臨床常用的多種抗生素表現較高的耐藥性，且耐藥譜不斷變廣。

1.2 G-菌耐藥產生機制

細菌耐藥機制包括內在耐藥和獲得耐藥[9]。內在耐藥是編碼染色體DNA的穩定遺傳特性，由該屬全部成員共享。細菌可通過宿主染色體DNA突變或得到攜帶耐藥基因的染色體獲得耐藥性[14]，其產生機制主要分為以下5類：

（1）產生使藥物失活的酶。耐藥菌能夠產生通過水解或修飾作用破壞抗生素結構使其失去活性的酶，如β-內酰胺酶可打開青霉素和頭孢菌素的內酰胺環，破壞藥物結構使其完全失去抗菌活性；氨基糖苷類抗菌藥物鈍化酶（氨基糖苷酰基轉移酶等）對氨基糖苷類分子中的必需基團進行化學修飾，使其與作用靶位核糖體的親和力大幅降低，如氯霉素乙酰轉移酶使氯霉素乙酰化，失去抗菌作用[15]。

（2）主動外排機制。存在于細胞膜內的蛋白質復合物可排出進入細胞質的抗生素和毒素，從而使細胞內有毒化合物濃度降低到亞毒性水平。這些蛋白質對不同結構抗生素的識別和外排存在不同的位點和機制[16]。

（3）藥物作用靶點改變。細菌能夠改變抗生素作用靶位的蛋白結構和數量，從而影響與藥物的結合。如肺炎鏈球菌耐紅霉素是由質粒介導的甲基化酶使23S rRNA中一個關鍵性的腺嘌呤殘基甲基化，使抗菌藥物進入胞內后無法與之結合發揮作用[17]。

（4）細胞膜通透性降低。細胞外膜上的孔蛋白是一種非特異性的、跨越細胞膜的水溶性擴散通道，抗菌藥物必須進入細菌內部到達作用靶點后才能夠發揮抗菌作用。細菌的細胞壁障礙或外膜通透性改變均可嚴重影響抗菌藥物的抗菌作用，如細菌細胞膜微孔缺失，亞胺培南難以進入胞內，從而失去抗菌作用[15]。

（5）細菌自身代謝狀態改變。細菌可通過改變自身狀態逃避藥物作用，休眠狀態或營養缺陷的細菌耐多種抗生素[10]。生物被膜是細菌為適應生存環境，吸附于生物或非生物表面的細胞群落，能夠阻止藥物滲透到細菌細胞內，具有保護細菌逃逸抗菌藥物的殺傷作用[7]。

2 中藥有效成分消除G-菌耐藥性研究現狀

張石磊等[18]研究發現，亞抑菌濃度小檗堿與多重耐藥大腸桿菌共培養3 d后，左氧氟沙星的最低抑菌濃度（MIC）由16 mg/L降至8 mg/L，表明小檗堿對大腸桿菌耐藥性具有消除作用。Qu等[19]研究發現，槲皮素與耐多黏菌素菌株共培養后，多黏菌素的MIC由4～256 mg/L降至1～64 mg/L，表明槲皮素可顯著提升耐藥菌對多黏菌素的敏感性。郭巖[20]研究發現，和厚樸酚能夠顯著恢復MCR-1陽性的大腸桿菌、沙門菌以及肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性。由此可見，中藥有效成分可通過多種耐藥消除機制降低G-菌大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性。

2.1 酶抑制劑

G-菌能夠產生抗生素的水解酶，使抗生素活性降低或失去活性，以β-內酰胺類酶最為普遍[21]，可水解β-內酰胺類抗生素的活性結構，使其失去抗菌活性。其中ESBLs和新德里金屬β-內酰胺酶（NDM-1）可降低β-內酰胺類抗生素對大腸桿菌的抑制作用。第二類抗生素的水解酶是氨基糖苷類修飾酶（AMEs），包括N-乙酰轉移酶（AAC）、O-核苷酸轉移酶（ANT）和O-磷酸轉移酶（APH）[22]，可通過共價修飾藥物上的特定氨基或羥基滅活氨基糖苷類抗生素，使抗生素失去抑菌活性。第三類是四環素鈍化酶，可通過降解四環素使其失去活性[20]。曹敏[23]研究發現，蘆薈大黃素、槲皮素、香紫蘇醇、木樨草素、苦參堿、大蒜素和五味子甲素7種中藥單體對β-內酰胺酶具有一定的抑制作用，其中，蘆薈大黃素對β-內酰胺酶活性抑制作用最強。茶提取物-黃素-3,3二氨基甲（TFDG）也能夠有效抑制ESBLs活性，增強β-內酰胺類藥物的藥效[24]。賈芳等[25]研究發現，2.5～15.0 g/L的苦豆子堿既可對大腸桿菌產生抑制作用，還可降低ESBLs活性。因此，中藥有效成分具有抑制酶活性的能力，可提高耐藥菌株對抗菌藥物敏感性。

2.2 外排泵抑制劑

G-菌依靠跨越雙膜的3種蛋白復合體從細胞中泵出抗生素。3種蛋白復合體包括抗性結瘤細胞分裂（RND）家族的內膜蛋白（IMP）、外膜蛋白（OMP）及連接兩個蛋白的胞膜融合蛋白（MFP）[26]。外排泵具有底物選擇廣泛的特點，以此形成對抗生素的非特異性耐藥。外排泵抑制劑（EPIs）的研發對恢復多重耐藥G-菌的敏感性具有重要意義。劉三俠[27]研究發現，經小檗堿處理的多重耐藥大腸埃希菌外排泵AcrA-mRNA表達量顯著降低，表明小檗堿能夠抑制細菌主要外排系統AcrAB-Tolc。Choudhury等[28]研究發現，香豆素能夠抑制銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵MexB蛋白表達，抑制細菌耐藥性。綜上，中藥有效成分能夠顯著抑制G-菌的外排泵作用以及相關基因的表達，從而消除細菌耐藥性。

2.3 生物被膜抑制劑

生物被膜是指細菌被自身產生的多聚復合物基質包繞的異質性細菌群體，附著于無活性物體或活體物體表面[15]。一般情況下，生物被膜通過降低菌體代謝速率和對抗生素的通透性阻止或減少抗生素進入體內，進而產生抗生素耐藥性[29]。景春娥等[30]研究發現，黃芩苷能夠降低阪崎克羅諾桿菌的附著性，抑制生物被膜形成，且鞭毛合成基因、生物被膜形成相關基因、生物被膜群體感應因子和轉錄調節因子轉錄水平均有所下調。張凱等[31]研究發現，不同濃度的厚樸酚對同一耐藥菌生物被膜形成均可產生抑制作用。黃盼等[32]研究發現，5 g/L的甘草酸可顯著抑制耐藥菌生物被膜形成，10 g/L的甘草酸處理的耐藥菌幾乎不形成生物被膜。綜上，中藥有效成分通過抑制耐藥G-菌生物被膜形成可消除G-菌耐藥性。

2.4 耐藥質粒消除劑

細菌產生耐藥性最主要的機制是獲得耐藥質粒[14]。耐藥基因在細菌之間轉移，可整合到細菌的染色體中，代代穩定遺傳，也可在細菌質粒上保持在染色體外狀態，由質粒介導的耐藥性可伴隨耐藥質粒的消除而逆轉。汪東海等[33]研究發現，與處理前相比，經0.1～1.0 g/L黃芩苷處理的鮑曼不動桿菌耐藥菌株質粒消除率為6.3%～37.5%，且呈劑量依賴性。王新興等[34]研究發現，MIC濃度的小檗堿可消除MCR-1陽性大腸桿菌耐藥質粒，消除率為26.9%；經熒光定量PCR檢測發現，經小檗堿作用后，由質粒編碼的MCR-1基因也被消除。綜上，中藥有效成分通過消除耐藥質粒達到消除G-菌耐藥性的作用。

3 中藥有效成分協同消除G-菌耐藥性

G-菌耐藥性產生由多重耐藥機制介導，單一消除劑無法抑制全部耐藥機制，多種消除劑聯合應用才是消除細菌多重耐藥機制的有效手段。徐倩倩等[35]研究發現，黃連-訶子、山楂-蘆薈、蘆薈-烏梅等7對中藥聯合應用時顯示協同作用，FIC指數為0.28～0.50；黃連-山楂、蘆薈-五味子等9對藥物聯合應用呈現相加作用，FIC指數為0.56～1.00；27對藥物聯用呈現拮抗作用，FIC指數均大于2。王芝超[36]發現，山楂可消除1～3條耐藥大腸桿菌耐藥質粒條帶，黃連可抑制耐藥菌β-內酰胺酶活性，降低大腸桿菌外排泵AcrAB-TolC轉錄水平，生物被膜由強附著性變為弱附著性，山楂黃連組方對雞源大腸桿菌病治愈率達90%。

4 結論

目前對中草藥復方消除細菌耐藥研究較多，但中藥成分復雜，藥效受采摘季節、產地、炮制方式、制備濃度等諸多因素影響，導致臨床治療細菌性疾病尚無統一標準。而藥效明確、濃度可控的中藥有效成分可避開此弊端，更具臨床應用價值。因此，研發多靶點消除細菌多重耐藥性的中藥有效成分消除劑是發展趨勢。