生物被膜形成對大腸桿菌致病性的影響

曠年玲，左麗，呂興幫，鄧聰聰，宋瑞銘，張永英，2*

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038；2.河北省禽病技術創新中心，河北 邯鄲 056021）

1 生物被膜研究進展

生物被膜是一種結構復雜的微生物群落，即細菌細胞被自身產生的胞外聚合物（EPS）包圍[1]。EPS主要由多糖、蛋白質、脂質和核酸（RNA和細胞外DNA）組成，共同形成高度水合的極性混合物，有助于形成維持生物被膜的三維結構[2]，并在抗菌劑和壓力環境中保護細菌[3]。生物被膜細菌的生活方式是無休止的循環，生物被膜細菌形成過程可概括為以下5個主要階段：黏附（微生物通過弱相互作用，如范德華力可逆吸附于生物或非生物表面）、定植（微生物通過鞭毛、菌毛、脂多糖、胞外多糖、膠原結合黏附蛋白等更強的親疏水相互作用，不可逆地附著于生物或非生物表面）、發育（細胞增殖形成多層細胞，產生和分泌EPS）、成熟（在生物被膜內穩定形成三維群落，其中包含有效分配營養物質和信號分子通道）、主動擴散（微生物細胞由于內外因素的相互作用而成團分離或單個分離，散布的細胞隨后在其他位置定植）。在上述動態過程中，具有特定的酶參與生物被膜的降解和重組，不僅導致基質的部分降解，還參與生物被膜的主動分散和隨后的表面再定植。附著是生物被膜形成的開始，但主動擴散不是結束，而是下一輪生物被膜形成的開始。生物被膜的連續再循環賦予了微生物適應各種極端環境的能力[2]。

在自然環境中，約40%～80%的細菌以生物被膜為主要生活方式[2]。與浮游細菌相比，生物被膜菌的生長速率、代謝和基因表達譜均具有顯著改變。嵌入生物被膜的細菌代謝活性降低，且其細胞外基質會形成保護屏障對抗抗菌藥物和動物免疫系統，是生物被膜菌難以治療的根本原因[4]。在乳制品、家禽、肉類和即食食品工業中，食物中毒的暴發與形成生物被膜的病原體有關[5]，其中65%～80%的細菌感染均與細菌生物被膜有關[4]。由此可見，細菌生物被膜的形成與其致病性密切相關。

2 生物被膜與致病性的相關性

生物被膜與其他定植感染不同，生物被膜是聚集在生物或非生物表面的細胞微菌落[6]。生物被膜形成的屏障可通過減少藥物滲透，阻礙抗菌藥物對細菌的治療，從而導致治療失敗，同時還阻礙了免疫系統對微生物的識別[1]。更為重要的是，生物被膜的形成可作為保護機制對宿主產生深遠的影響。此外，由于在生物被膜中生長的微生物細胞較為聚集，感染性因子均勻分布受到挑戰，易受到宿主免疫反應或抗生素治療的影響。

血管內皮細胞的相關感染是第一個被確定為具有生物被膜病因的臨床感染，表明生物被膜的形成可促進動物炎癥反應，原因是動物炎癥因子有助于病原菌附著。經皮膚或口腔進入血液的細菌可在植入的心臟瓣膜或內皮表面定植，形成生物被膜，導致細菌性心內膜炎，表明細菌贅生物表面附著是微生物細胞與宿主產物相互作用的結果[6]。此外，生物被膜內的細菌生長速度緩慢，營養滲入受到抑制，增強了生物被膜抵抗抗菌劑的能力，加之細菌致病基因表達，最終導致動物患病并且增加了治療難度[7]。

細菌的附著是生物被膜形成的首要條件，受細菌表型、基因型、基質、營養物質、離子強度、pH值和溫度的影響。大腸桿菌通過黏附素、鞭毛、Ⅰ型菌毛、卷曲纖維和腸上皮細胞消失位點等特異性毒力因子附著于非生物和生物表面的能力，是啟動感染和生物被膜形成過程中復雜而關鍵的一步[8]。由于生物被膜內的菌細胞密度較浮游狀態多，且大多數受營養物質和氧氣等條件的限制。生物被膜生長狀態下的大腸桿菌與其對數期和穩定期的同種浮游菌相比，共有4 290種基因表達發生改變?；蚓幋a的蛋白質涉及糖類代謝、能量代謝、酶、轉運蛋白、轉運/結合蛋白以及一些功能未知的蛋白質，且同種細菌在生物被膜狀態下與其他生長階段的基因表達有較大差異[7]。同時，生物被膜的產生與其毒力基因也顯著相關[9]。

3 毒力基因與生物被膜

生物被膜狀態下細菌毒力基因及抗性基因的表達與浮游菌存在較大差異，不同細菌在生物被膜形成與維持過程中的基因表達不同，在細菌生物被膜的不同時期基因表達也存在差異[10]。此外，毒力基因及抗性基因在生物被膜的形成過程中也發揮較大作用。研究發現，致病性大腸桿菌菌株在感染動物的不同階段利用多種毒力因子定植和入侵宿主，如黏附素、毒素、鐵獲取系統和抗吞噬活性[11]。

3.1 外膜蛋白

外膜蛋白（OMPs）具有多種功能，包括維持細胞膜膜結構穩定性、主動和被動運輸離子及溶質、信號轉導、防御和催化。大多數OMPs暴露在細胞表面，對細菌與哺乳動物及其防御系統、噬菌體和其他細菌或微生物的接觸十分重要[12]。大腸桿菌與腸桿菌科的其他成員相同，可通過改變外膜通透性進而影響其對抗生素的耐藥性，而滲透率的降低通常與孔隙結構或生產中的缺陷有關[13]。

外膜蛋白A（OmpA）是大腸桿菌中主要的熱變性外膜蛋白，是最具代表性的外膜蛋白之一[12]。OmpA在生物被膜形成、宿主細胞侵襲、孔隙形成和多重耐藥性中起到重要作用，故大腸桿菌的OmpA對致病性具有關鍵作用，是大腸桿菌感染的主要毒力因子[14]。與OmpA缺失株相比，含OmpA菌株的侵襲程度相差約25～50倍[15]。OmpA可促進聚苯乙烯表面的大腸桿菌K-12的生物被膜形成[16]。Barrios等[17]研究發現，OmpA與大腸桿菌生物被膜的形成密切相關；在M9培養基中，OmpA缺失株的生物被膜減少72%了；LB培養基中，OmpA缺失株的生物被膜減少83%。也有研究表明，大腸桿菌的OmpA在生物被膜形成中過量表達[10]。OmpF和OmpC是大腸桿菌兩種主要的運輸通道[18]，也是與通透性有關的主要外膜孔蛋白。然而上述兩種運輸孔均為非特異性，允許親水分子的擴散，包括β內酰胺類抗生素[13]。此外，ompC缺失會降低大腸桿菌對腸道細胞的黏附和入侵能力[19]。ompF的缺乏可對生物被膜中某些糖類和脂質的含量產生負面影響[20]，從而抑制生物被膜的形成。

3.2 Ⅰ型菌毛

Ⅰ型菌毛由fim基因群編碼的亞單位基因FimA和輔助蛋白基因FimC、FimD以及調節基因FimB、FimE和黏附復合物基因FimF、FimG、FimH組成[21]。Ⅰ型菌毛可促進細菌黏附和生物被膜形成[22]，是大腸桿菌最初附著于非生物表面的必需條件，對大腸桿菌在非生物表面的不可逆黏附具有重要意義[23]。大腸桿菌生物被膜在物體表面的附著能力是大腸桿菌毒性相關的重要特征，病原菌的表面毒力因子包括可促進細菌黏附和生物被膜形成的不同附著因子。與生物被膜形成能力較差的菌株相比，生物被膜形成能力中等和較強的菌株表現出更高的Ⅰ型菌毛表達水平。在尿路致病性大腸桿菌中，Ⅰ型菌毛具有促進生物被膜形成的能力，并在附著泌尿生殖道引發感染的過程中產生關鍵作用。通過禽致病性大腸桿菌Ⅰ型菌毛基因缺失株對人肺上皮細胞及嗜中性粒細胞的附著試驗，發現禽致病性大腸桿菌的Ⅰ型菌毛具有促進細胞附著與定植作用。此外，兩株生物被膜形成能力不同且均有具有甘露糖敏感性血凝試驗（MSHA）活性的鼠傷寒沙門菌分離株，區別在于fimH的兩個氨基酸位點出現突變，位于61位的甘氨酸置換成丙氨酸，菌株可擁有形成生物被膜的能力[24]。

3.3 纖維素

纖維素是常見的生物被膜成分[25]，也是線性的胞外多糖[26]，由纖維素合成酶合成。BcsA、BcsB和BcsC基因是纖維素合成多酶復合體的保守亞基，編碼在一個操縱子。BcsA和BcsB是兩個催化亞基，存在于所有bcs酶中，其中BcsB可將聚合物引向外膜。BcsA-B可通過尿苷5'-二磷酸葡萄糖和c-di-GMP激活劑合成纖維素，C-di-GMP被認為是該細菌中纖維素生物合成的激活劑[27]。細菌纖維素參與生物被膜的形成，能夠嵌入固著菌群[26]。與野生型菌株相比，重組BcsA+菌株產生的纖維素量無顯著差異，且需要其他亞基才能發揮其催化活性。因此，BcsA和BcsB必須在同一膜中才能形成功能化合物，可能與BcsA和BcsB應附著在一個多肽上有關。

為進一步增強和加快細菌纖維素生成，需要更多的基因參與木聚糖在大腸桿菌中的評估和過表達[27]。Aly等[26]研究發現，BcsA和BcsB基因的缺失與生物被膜的減少相關。在不同環境條件下，攜帶BcsA菌株的生物被膜形成能力顯著高于不攜帶BcsA的菌株。徐諾[28]和陰銀燕等[29]研究發現，沙門菌BcsA缺失株的生物被膜形成能力下降。

3.4 溶血素

溶血素E（HlyE）是由大腸桿菌和其他腸道細菌合成的新型成孔毒素[30]。HlyE可影響Ca2+在上皮細胞中的信號傳導，還能夠誘導人和小鼠巨噬細胞的凋亡，并引起人類、兔子、綿羊和馬紅細胞溶血[31]。感染傷寒桿菌或副傷寒桿菌的機體內存在HlyE抗體，且HlyE可在機體巨噬細胞中表達并抑制細菌生長，導致慢性感染。目前測試的所有野生型傷寒和副傷寒菌株均具有HlyE功能性蛋白，表明HlyE可在這些細菌的發病機制中發揮作用[30]。此外，SlyA是MarR家族細菌轉錄調節劑的成員，能夠直接調節大腸桿菌的HlyE。SlyA能夠促進4種隱性纖膜樣黏附素轉錄，且當SlyA過度表達時形成的生物被膜比未過度表達時增加了4倍[32]。

3.5 腸毒素

產生熱不穩定（LT）和熱穩定（ST）腸道毒素大腸桿菌是腹瀉病的主要原因。細菌黏附素和腸道毒素是產腸毒素大腸桿菌致宿主腹瀉的毒力決定因素[33]。高效LT遞送到宿主細胞最有可能通過含有LT的囊泡發生，表達LT的菌株在定植方面也具有一定優勢。LT基因的消除和伴隨的毒性降低與在生殖道內定植減少有關，表明這種腸毒素在細菌附著過程中發揮作用。Dubreuil等[34]研究表明，LT可促進產腸毒素大腸桿菌的依從性，可能需要ADP-核糖基轉移酶活性。葡萄糖在LT表達的最佳濃度下，可促進LT產生，增強細菌附著性。

3.6 血清抗性基因

部分編碼黏附素、毒素或鐵獲取系統的基因在禽大腸桿菌病發病過程中具有潛在的重要作用，如毒力基因之一的ISS（增加血清存活）基因可參與疾病的發病機制。與健康禽類大腸桿菌分離株相比ISS基因在亞太經合組織禽病分離株中更為普遍，且ISS基因及其外膜蛋白產物是禽致病性大腸桿菌潛在的毒力檢測目標[35]。ISS基因存在于Col V質粒上，其編碼的ISS蛋白屬于外膜蛋白的一部分[36]。白灝等[37]研究發現，大腸桿菌生物被膜形成能力增強可能與ISS和ompA轉錄水平上調有關。

3.7 毒力島

3.7.1 LEE致病島

腸道致病性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌是引起腸道黏膜損傷的兩種重要致病菌，通過附著和脫落損傷（AE損傷）定植于腸道黏膜。誘導AE損傷的能力需要致病性毒力島，即腸細胞消失位點（LEE）[38]。LEE是35 kb的基因簇，參與附著和消隱病變的形成、黏附腸上皮細胞和宿主信號轉導通路的啟動[8]。腸道致病性大腸桿菌的LEE毒力島包含AE損傷及其他毒力因子相關的所有編碼基因，主要編碼Ⅲ型分泌系統（ESC或SEP）、分泌型蛋白質（ESP）及其分子伴侶、外膜蛋白緊密素（EAE）和緊密素易位受體（TIR）等[8,38]。3型分泌系統作為細菌和宿主細胞之間的橋梁，傳遞對宿主細胞施加改變的效應分子。基因組島LEE在腸道致病性大腸桿菌菌株生物被膜的形成過程中具有重要作用。Mathlouthi等[39]研究發現，LEE失活的大腸桿菌附著于非生物表面時效率降低，表明LEE操縱子在生物膜的形成中具有至關重要的作用。

3.7.2 HPI毒力島

高致病性島（HPI）是35～45 kb的基因簇，是攜帶鐵載體介導的鐵攝取系統。HPI廣泛分布于腸桿菌科，物種間高度保守，大腸桿菌和耶爾森菌的同源性為98%～100%。HPI不僅有助于鐵的吸收，還可增強大腸桿菌的毒性，對大腸桿菌致病性的貢獻十分復雜。HPI可增強大腸桿菌致病性，產生更嚴重的細胞病變效應，從而提高感染動物的病死率。HPI與致病性大腸桿菌感染巨噬細胞和自噬增強相關，其中包括PI3K/Akt/mTOR通路下調增強，也可影響致病性大腸桿菌感染3D4/21細胞中某些細胞因子分泌。HPI產生的耶爾森菌素可與鐵離子、銅離子和鋅離子結合，對病原菌在不同感染條件下的致病性十分重要。腸外致病性大腸桿菌中的HPI通過促進鞭毛運動使菌株適應周圍環境。此外，HPI參與大腸桿菌的一些生物合成和代謝途徑，如中心碳代謝和主要代謝組[40]。許綿[41]研究發現，與野生菌株對比，HPI缺失株生物被膜形成能力下降了50.97%，附著能力下降了23.3%。吳文文等[42]研究發現，缺失HPI基因的F4ac+豬腸毒性大腸桿菌菌株，生物被膜形成能力及對IPEC-J2細胞的附著能力均顯著下降，表明HPI可能在豬腸毒性大腸桿菌附著過程中發揮一定作用。

生物被膜作為對抗抗菌劑和消毒劑的保護機制，是改善細菌生物適應性的手段。生物被膜幾乎可在任何非生物表面形成，也可在有機體內部形成。部分大腸桿菌菌株可形成難以根除的生物被膜，并導致感染，上述感染源于導管、假體心臟瓣膜、心臟起搏器和替代關節，導致發病率和病死率提高[43]。生物被膜菌在小腸中定植的效率比浮游菌定植有效率高7～10倍。感染生物被膜細菌的小鼠也表現出嚴重的腹瀉癥狀，表明無論何種形成表面，生物被膜生長菌均處于過度感染狀態，并且毒力基因的總體轉錄豐度較高[44]。

4 結論

大腸桿菌中許多毒力因子對其生物被膜的形成具有顯著影響，大腸桿菌形成生物被膜后，各毒力基因轉錄情況發生變化，而生物被膜對大腸桿菌致病性具有較大影響。雖然，關于生物被膜的認識已有一定進步，但對其引起的疾病和治療方法的研究仍較少，需要制定有效的戰略對抗致病性生物被膜。因此，應在檢測大腸桿菌形成生物被膜后，了解各類型毒力基因轉錄情況，確定生物被膜對各類毒力基因的影響，從而為治療大腸桿菌病和開發新藥物提供參考。