糖尿病視網膜病變伴糖尿病腎病患者轉錄組學差異分析

陳建斌 劉穎 張華北 李志琛 何徐軍 梅偉群 錢佳麗 歐陽建

糖尿病視網膜病變（DR）和糖尿病腎病（DN）是糖尿病（DM）常見的微血管并發癥。隨著全球糖尿病患病率的增加，DR和DN引起的視力喪失及腎功能衰竭嚴重危害患者的健康甚至生命。DM患者中，DR和DN同時或先后發生的比例較高，表明兩者可能存在共同的發病機制。本研究采用轉錄基因組測序技術檢測入組患者外周血白細胞，從中篩選DR伴DN差異表達基因，為進一步明確DR伴DN易感基因提供候選基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年2月至10月聯勤保障部隊第903醫院T2DM患者14例，其中6例不伴DN和DR納入DM組，8例伴DR和DN納入DNDR組。入選患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標準［1］。DM組納入標準：眼底照相除外DR，ACR＜30 mg/g。DNDR組納入標準：①依據2002年DR國際分期標準［2］。雙眼眼底彩色照相檢查符合中度以上非增殖性DR（NPDR）或增殖性DR（PDR）；②依據2012年ADA篩查和診斷標準。即時尿標本的白蛋白/肌酐（ACR）＞30 mg/gCr，且3個月內監測3次ACR至少有2次升高。排除標準：①T1DM、妊娠糖尿病和特殊類型糖尿病；②閉角型青光眼及葡萄膜炎患者；③除DR外的其他視網膜疾病；④高血壓、冠心病、慢性阻塞性肺病、惡性腫瘤、腦卒中；⑤劇烈運動、發熱、尿路感染、腎病綜合征等其他原因導致ACR升高。兩組患者糖化血紅蛋白水平、病程、年齡差異均無統計學意義。本項目經聯勤保障部隊第903醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）主要試劑及儀器：北京愛普華美生物科技有限公司對每份外周血白細胞樣本進行RNA抽提、文庫構建和質檢，華大基因公司對轉錄組文庫進行測序和數據質控。采用熒光定量PCR技術檢測蛋白激酶C delta結合蛋白（PRKCDBP）基因、CD177抗原（CD177）基因的mRNA表達。RNase OUT?（5,000 U）（10777-019）、5X第一鏈緩沖液（18064-015）、5X第二鏈緩沖液（10812-014）、SuperScript III逆轉錄試劑盒（18064-014）、Trizol（15596026）、Dynabeads mRNA 純化試劑盒（610-06）、苯酚/氯仿/異戊醇（15593-31）購自美國Invitrogen公司；Phusion DNA聚合酶（F-531L）、外切核酸酶1（M0293S）、DNA連接酶（M2200L）均購自美國NEB公司；紅細胞裂解液（批號RT122-02Lot//N2214）購于杭州開泰生物技術有限公司；dNTPs混合物（BF7801A）、熒光定量PCR試劑盒TB Green?Premix Ex Taq? II（TliRNaseH Plus）購自日本TaKaRa公司；GAPDH引物、CD177、PRKCDBP均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。PTC-100型PCR儀購自美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統（Tanon）購自上海天能科技有限公司；紫外線分光光度儀（nanodrop1000）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；安捷倫2100生物分析儀購自美國Agilent公司。（2）白細胞分離：空腹采集患者外周血，加入裝有抗凝劑（乙二胺四乙酸二鉀，EDTA-K2）的血常規管中。離心后沉淀部分加入紅細胞裂解液，期間再顛倒混勻幾次，沉淀中加入1 mL Trizol試劑，分離后的白細胞分裝，放置冰箱保存。（3）RNA提取、反轉錄和轉錄組測序：采用RNA提取試劑盒提取總RNA，nanodropRNA質檢和安捷倫2100生物分析儀檢測RNA完整度，然后進行測序。（4）轉錄組測序數據的過濾和評估：由Illumina HiSeq TM 2000測序所得的數據為raw reads。通過軟件得到clean reads，并進行質控。（5）基因表達注釋和定量：將clean reads比對到參考基因組和參考基因序列，統計其分布情況及覆蓋度。利用每個堿基長度reads數計算基因表達量。（6）GO以及Pathway顯著性富集分析：基因本體（GO）包括3個本體：分別描述參與的生物過程GO-P、所處的細胞位置GO-C、分子功能GO-F。應用超幾何檢驗，再通過富集分析確定差異基因的主要生物學功能。通過生化代謝與信號轉導通路（Pathway）顯著性富集分析確定差異基因參與的主要生化代謝和信號轉導途徑。（7）基因相互作用網絡分析：對差異表達基因、直接相互作用的基因進行基因互作網絡分析。（8）RT-qPCR驗證：實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測PRKCDBP、CD177的mRNA相對表達量。同時繪制熔解曲線，采用2-ΔdΔCT法計算目的基因的相對表達量。引物序列如下：PRKCDBP-forward：5'-CACGTTCTGCTCTTCAAGGAG-3'，PRKCDBP-reverse：5'-TGTACCTTCTGCAATCCGGTG-3'；CD177-forward：5'- CGGCAATGGACCCCTAAGAAC-3'，CD177-reverse：5'- AACGAGGTTGTTGCAGAAGTC-3'；GAPDH-forward：5'- CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，GAPDHReverse：5'- AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。取DM及DNDR組基因表達量的均數（mean）和中位數（median），分別計算兩組間各個基因相應的ratio值。差異表達基因的設定標準為mean和median倍數上下調均≥2.0倍。PRKCDBP和CD177mRNA表達量以（）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質控結果 nanodropRNA質檢和安捷倫2100檢測14份樣本RNA質量均合格，采用RNA-seq和qPCR定量兩種方法對轉錄組文庫質檢均合格。全部樣本數據過濾后Q20比例均＞93.9%，GC含量為46.61%～49.15%，clean reads比例平均占raw reads的＞97%，測序數據良好。reads在基因覆蓋度以及參考序列上的分布情況均合格，可用于后續分析。

2.2 差異表達基因 與DM組比較，DNDR組所篩選出的差異表達基因98個，上調42個，下調56個。見表1。

表1 DRDN與DM組比較差異表達基因

2.3 GO注釋和富集分析結果 見圖1。

圖1 差異基因本體分析

2.4 Pathway顯著性富集分析 差異表達基因參與77條Pathway（圖2結果顯示富集到差異基因最多的前20條Pathway），其中最顯著的為移植物抗宿主病、系統性紅斑狼瘡以及抗原處理和遞呈。上調最明顯的ABHD11反義 RNA 1（ABHD11 antisense RNA 1，ABHD11-AS1）未富集到相關Pathway，下調最明顯的絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4前體（SPINK4）參與ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）Pathway。

圖2 前20 pathway富集分析圖

2.5 差異基因相互作用網絡分析 差異基因對應的蛋白相互作用網絡，PDZ結合激酶（PBK）與蛋白激酶C delta結合蛋白（PRKCDBP）、Ras關聯域家族成員6（RASSF6）相互作用。KIR2DL1與KIR2DS1存在相互作用。見圖3。

圖3 基因相互作用網絡分析圖

2.6 PRKCDBP和CD177mRNA表達RT-qPCR檢測結果 DNDR組PRKCDBPmRNA表達量低于DM組，DNDR組CD177的mRNA表達量高于DM組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 2組PRKCDBP和CD177 mRNA表達比較

3 討論

糖尿病發病率逐年升高，嚴重威脅人類健康，我國約20%～40%的DM患者合并DN［3］，而糖尿病患者中約有1/3 出現糖尿病視網膜病變癥狀［4］。研究發現，嚴格控制血糖可降低DR和DN的發生風險，但不能完全阻止其發生和進展［5］。臨床觀察顯示，部分DM患者持續高血糖但不發生微血管并發癥，而部分DM患者病程較短，血糖控制良好，卻發生嚴重的DR和DN。在單卵雙生雙胞胎中，DR和DN的患病率一致［6］，表明遺傳因素在DR和DN發病中具有重要作用。

本研究共篩選出98個DNDR差異表達基因，為進一步驗證DRDN易感基因提供了候選基因。差異基因相互作用網絡分析顯示多個差異基因之間存在相互作用，富集性分析發現一個基因可以參與多個GO或Pathway，也可以多個基因參與一個GO或Pathway，表明DNDR發生發展是多基因相互作用的結果。

KIR2DL1、KIR2DS1通過自然殺傷細胞介導的細胞毒性調節NK細胞活性，在抗原處理與提呈過程中發揮作用。有文獻報道，活化的KIR2DS1受體與自身免疫性疾病［7］，病毒感染的控制［8］、惡性腫瘤［9］等有關。KIR2DL1是NK細胞表面主要的抑制性因子，PARHAM等［10］發現，KIR2DL1識別KG1A細胞株表面HLA-C2表型，可抑制NK細胞對KG1A細胞的殺傷活性。KIR2DL1作為NK細胞表面主要的抑制性因子，在各種惡性腫瘤免疫效應中發揮重要作用。SHASTRY等［11］研究發現，KIRs與糖尿病易感性相關且存在種族差異。在拉脫維亞成人患者中，KIRs 2DL1、2DS2和2DS4是易感因子，2DS5是保護因子；而在印度成人患者中，KIRs 2DL5和3DL1是易感因子，2DS1和2DS3是保護因子。本研究中DNDR組KIR2DL1、KIR2DS1下調，KIR2DL1、KIR2DS1與DR伴DN之間的關系仍需進一步驗證。

文獻報道，上調最明顯的ABHD11-AS1基因主要與腫瘤有關［12-13］，下調最明顯的絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4型（SPINK4）參與ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）的Pathhway SPINK4在乳糜瀉（CD）患者中顯示差異基因表達，在未治療患者中最高，在無谷蛋白飲食開始時急劇下降，與CD病理改變相關的差異基因表達，可能來自杯狀細胞活性的改變［14］。PIETZ等［15］發現活動性CD的腸上皮細胞中SPINK4顯著上調，活動性CD中，SPINK4和抗微生物凝集素1（ITLN1）的表達水平的顯著增加表明對細菌的先天免疫。研究揭示下調最明顯的SPINK4與炎癥過程有關，而在DNDR發病機制中的作用仍待深入研究。

PRKCDBP，又稱為細胞膜穴樣內陷相關蛋白3（CAVIN3），通過CAVIN1靶向細胞膜穴樣內陷，與窖蛋白1（caveolin1）的支架結構域相互作用并促進細胞膜穴樣內陷動力學［16］，CAVIN3缺失減少平滑肌中細胞膜穴樣內陷的數量，且部分使CAVIN1不穩定，使血管對一氧化氮的敏感性升高，在嚴重細胞應激的情況下干擾高爾基體內穩態。ZHU等［17］研究發現，CAVIN3有助于體內平滑肌中細胞膜穴樣內陷的形成。CAVIN3消融使平滑肌細胞中細胞膜穴樣內陷的密度降低40%～45%，而內皮細胞保持細胞膜穴樣內陷豐度。PRKCDBP是一種推定的腫瘤抑制因子，已經在幾種癌癥中觀察到改變［18］，也有研究發現與潰瘍性結腸炎（UC）有關，PRKCDBP被鑒定為響應腫瘤壞死因子（TNF）-α而被核因子-κB激活。PRKCDBP的黏膜表達與UC患者中的TNF-α表達強烈相關，且IFX治療導致PRKCDBP和TNF-α的顯著降低。因此，這些發現支持PRKCDBP表達受TNF-α嚴格控制，且IFX的抗炎作用可能部分源于阻斷TNF-αPRKCDBP信號傳導途徑［19］。本研究中PRKCDBP明顯下調，其對DR、DN的影響是否與血管平滑肌內陷或炎癥作用有關需進一步研究。

編碼分泌信號蛋白結構的相關基因組成了WNT基因家族。WNT3通過激活WNT-β-catenin信號通路參與腫瘤發生，WANG等［20］發現胃癌中的WNT3表達顯著升高，表明上調的WNT3可以通過誘導癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并通過抑制癌細胞的凋亡在胃腫瘤發生中起關鍵作用。研究發現［21］WNT3可通過WNT3α/β-catenin信號通路影響足細胞，可能與腎病有關。ZHOU等［22］報道，WNT信號通路在年齡相關性黃斑變性和DR動物模型的視網膜和視網膜色素上皮細胞中被激活，誘導血管生成和炎癥因子的過量產生。另一方面，由經典WNT途徑的激活誘導ROS產生可能通過NF-B途徑促成炎性因子的過表達，反過來炎性因子的過度表達加劇炎癥的發展，經典WNT途徑的激活誘導視網膜炎癥和氧化應激，在DR中發揮致病作用，本研究中WNT3上調，上述機制是否參與其在DR、DN發病中的作用需進一步探討。

CD177是由可變比例的人嗜中性粒細胞表達的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，其介導抗中性粒細胞胞質抗體（ANCA）抗原蛋白酶3的表達，D177與β2整聯蛋白結合并識別血小板內皮細胞黏附分子［23］。在抗中性粒細胞胞漿抗體相關的系統性血管炎（AASV）患者中發現膜表達蛋白酶3（PR3）的增加依賴于CD177表達，并且與CD177基因的轉錄相關，中性粒細胞亞群向MPR3+/CD177+表型轉變與成熟中性粒細胞過度產生CD177有關，表明CD177在中性粒細胞遷移中的作用。成熟的MPR3和CD177在包括AASV患者在內的所有個體的中性粒細胞質膜上共同表達。AASV和SLE患者的中性粒細胞中，MPR3+/CD177+表型以及PR3和CD177的mRNA表達增加［24］，以上研究表明CD177與炎癥有關。本研究中DNDR組CD177表達上調，其在DR、DN發病中的作用是否與其致炎癥作用有關，需進一步證實。