枸橘苷對人骨肉瘤U-2 OS 細胞的抑制作用*

唐 捷，張丕軍，林 維，李超藝

（海南醫學院第二附屬醫院骨科二區，海南 海口 570311）

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：Thermo HERA cell 150i型細胞培養箱、7500型反轉錄聚合酶鏈反應儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Read Max 1900 plus 型酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）；DS-500 型微量分光光度計（屹譜儀器制造＜上海＞有限公司）；PowerPac Universa1 型電泳儀（美國Bio - Rad 公司）；Tanon 4800 型化學發光成像儀（上海天能科技有限公司）；MF43-M 型顯微鏡（廣州市明美光電技術有限公司）。

試藥：枸橘苷（成都儀睿生物科技有限公司，批號為DG0073，含量≥98%）；CCK- 8 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號為C0037）；FBXO2過表達載體（pLVX - EGFP - C1 - FBXO2）和陰性對照（pLVX -EGFP-C1，NC）及兩者對應的慢病毒包裝（漢恒生物科技＜上海＞有限公司）；Trizol 試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號為15536749）；2 × SYBR Green qP‐CR Master Mix（美國Bimake 公司，批號為B21202）；FBXO2 抗體（批號為ab133717）、LC3B 抗體（批號為ab192890）、Beclin1 抗體（批號為ab210498）、p62 抗體（批號為ab109012），均購自英國Abcam公司；p-STAT3抗體（批號為4074s）、STAT3 抗體（批號為9139s），均購自美國Cell Signaling Technology 公司；GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號為10494-1-AP）；超敏ECL 化學發光工作液（上海翊圣生物科技有限公司，批號為36208ES60）。

細胞：人骨肉瘤細胞株U - 2 OS（上海繼和生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

U - 2 OS 細胞用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640 培養基，于37 ℃及5% CO2培養箱中培養。待細胞密度為80%～90%時，用胰酶液消化細胞，以含10%FBS 的RPMI 1640 培養基重懸細胞，按1∶3 比例傳代培養。

1.2.2 枸橘苷對U-2 OS 細胞的半數抑制濃度（IC50）

收集不良反應監測數據庫中我院2016-2017年89位患者在接受121例/次化療過程中所出現的Ⅳ度骨髓抑制不良反應病例，化療前患者血象正常，且KPS評分在70分及以上。收集統計患者的一般情況、腫瘤類型、化療方案及治療方案的臨床用藥問題數據資料，分析骨髓抑制的發生特點、相關影響因素及用藥合理性。根據世界衛生組織（WHO）分度標準，血紅蛋白＜65g/L，或白細胞計數＜1.0×109L－1或絕對中性粒細胞計數＜0.5×109L－1，或血小板計數＜25×109L－1為化療所致毒性反應分級的Ⅳ度骨髓抑制。患者既往治療歷史見表1。

取對數生長期的U - 2 OS 細胞，接種至96 孔板中（5×103個/孔），于37 ℃及5% CO2培養箱中繼續培養24 h。將細胞分為枸橘苷①組、②組、③組、④組、⑤組、⑥組、⑦組（分別予枸橘苷0，5，10，20，40，80，160 μmol/L），每組設3個復孔。另設空白組，僅有培養基和枸橘苷溶液。每孔加入相應藥液繼續培養24 h，再加入10 μL CCK-8反應液，37 ℃孵育4 h后，檢測450 nm波長處的吸光度（OD），平行操作3 次。細胞活力（%）=（OD枸橘苷組-OD空白組）/（OD枸橘苷①組-OD空白組）×100%，以GraphPad Prism 5.0軟件計算枸橘苷對U-2 OS細胞的IC50。

1.2.3 U-2 OS 細胞實驗

分組：分為空白對照組［等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）］和枸橘苷低、高劑量組（26 μmol/L和52 μmol/L）。

細胞活力：采用CCK - 8 法檢測。取對數期生長的U - 2 OS 細胞，接種至96 孔板中（5 × 103個/ 孔），于37 ℃及5% CO2培養箱中分別培養0，24，48，72 h；每孔加入10 μL CCK-8 反應液，37 ℃培養箱中孵育4 h，檢測各孔在450 nm波長處的OD。每組設3個復孔，實驗重復3次。

細胞增殖：采用集落形成實驗。取對數生長期的U- 2 OS 細胞，接種至24 孔板中（300 個/ 孔），于37 ℃及5% CO2培養箱中連續培養2 周。棄去培養基，以4%多聚甲醛固定細胞，用0.1%結晶紫染液染色1 h，以流水緩慢洗去染液，室溫下干燥。記錄各組細胞克隆形成數。

FBXO2 mRNA 表達水平：采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT - PCR）法。收集轉染后的U - 2 OS 細胞，采用Trizol 法提取總RNA。采用微量分光光度計測定RNA的濃度，并反轉錄制備cDNA。引物序列，FBXO2，上游（5′ - 3′）ACTTGGAAGGCTGGTGTGAC，下游（5′ - 3′）TCAAAGGAGGAGGCGAAGTA；GAPDH，上游（5′ - 3′）GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT，下游（5′ - 3′）GGGGT‐CATTGATGGCAACA。反應程序，95 ℃、5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 個循環；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算FBXO2 mRNA的相對表達水平。

細胞中FBXO2，LC3Ⅰ，LC3Ⅱ，Beclin 1，p62，p -STAT3，STAT3蛋白表達水平：采用Western blot法。收集U-2 OS細胞，以RIPA裂解液裂解細胞。4 ℃、12 000 r /min離心20 min，取上清液，采用BCA 法檢測蛋白含量。取30 μg 上樣，10%SDS-PAGE 電泳后電轉。以封閉液室溫封閉2 h，加入FBXO2（1∶1 000，V/V），LC3B（1∶1 000，V/V），Beclin1（1∶1 000，V/V），p62（1∶1 000，V/V），p - STAT3（1∶2 000，V/V），STAT3（1∶2 000，V/V），GAPDH（1∶5 000，V/V）抗體，4 ℃孵育過夜。以辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2 000，V/V）室溫孵育1 h。加超敏ECL化學發光工作液，采用化學發光成像儀檢測蛋白條帶。通過Image J軟件將條帶灰度值數字化，目的條帶與內參條帶灰度比值為各目的蛋白的相對表達水平。

1.2.4 慢病毒轉染細胞實驗

分組：分為枸橘苷組（A組）、空白對照組（B組）、枸橘苷對照組（C 組，52 μmol / L）、枸橘苷+ FBXO2 組（D 組，52 μmol/L）。A 組僅加入枸橘苷（52 μmol/L）及相應培養基；B組僅加入等體積PBS及相應培養基。

慢病毒轉染：取對數生長期的U-2 OS 細胞，接種至96 孔板中（4×105個/孔），于37 ℃及5%CO2培養箱中培養48 h；棄去舊培養基，加入含5 μg/mL polybrene和2% FBS 的RPMI 1640 培養基，C 組加入50 MOI NC（pLVX-EGFP-C1），D組加入50 MOI FBXO2（pLVXEGFP - C1 - FBXO2），B 組加入等體積PBS，4 組均培養48 h；棄去舊培養基，更換含10% FBS 的RPMI 1640培養基，各孔加入相應藥液，繼續培養48 h。

檢測指標及方法：同1.2.3項。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U-2 OS 細胞實驗

IC50實驗結果顯示，枸橘苷對U - 2 OS 細胞的IC50為52.08 μmol/ L。故后續實驗中枸橘苷對U - 2 OS 細胞的抑制濃度選用為26，52 μmol/L。

細胞活力和增殖：與空白對照組比較，枸橘苷低、高劑量組U-2 OS 細胞在24，48，72 h 時的細胞活力顯著減弱，克隆形成數顯著減少（P＜0.05）。詳見圖1。

細胞自噬：與空白對照組比較，枸橘苷低、高劑量組U-2 OS細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），p62 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。詳見圖2。

細胞中FBXO2 表達和STAT3 通路：與空白對照組比較，枸橘苷低、高劑量組U - 2 OS 細胞中FBXO2 mRNA 和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），p -STAT3/STAT3顯著降低（P＜0.05）。詳見圖3。

2.2 慢病毒轉染細胞實驗

細胞活力和增殖：與B 組比較，A 組U - 2 OS 細胞在培養24，48，72 h 時活力顯著減弱（P＜0.05），克隆形成數顯著減少（P＜0.05）；與C 組比較，D 組U-2 OS細胞在24，48，72 h 時的細胞活力顯著增強（P＜0.05），克隆形成數顯著增加（P＜0.05）。詳見圖4。

細胞中FBXO2 mRNA 和蛋白表達：與B 組比較，A 組U-2 OS 細胞中FBXO2 mRNA 和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與C 組比較，D 組U - 2 OS 細胞中FBXO2 mRNA 和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見圖5。

細胞自噬：與B 組比較，A 組U - 2 OS 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），p62 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與C 組比較，D 組U-2 OS 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），p62 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖6。

a.顯微鏡視野 b.統計數據A.細胞活力 B.細胞增殖注：與空白對照組比較，*P ＜0.05。圖2、圖3同。圖1 枸橘苷對U-2 OS細胞活力和增殖的影響a.Field of microscope b.Statistical dataA.Cell viability B.Cell proliferationNote：Compared with those in the blank control group，*P ＜0.05（for Fig.1-3）.Fig.1 Effect of poncirin on the viability and proliferation of U-2 OS cells

1.空白對照組 2.枸橘苷低劑量組 3.枸橘苷高劑量組A.電泳圖 B.LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ C.Beclin1、p62蛋白表達圖2 枸橘苷對U-2 OS細胞自噬的影響1.Blank control group 2.Poncirin low-dose group 3.Poncirin high - dose groupA.Electrophoretogram B.LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ C.Expression of Beclin1 and p62 proteinFig.2 Effect of poncirin on the autophagy of U-2 OS cells

1.空白對照組 2.枸橘苷低劑量組 3.枸橘苷高劑量組B1，C1.電泳圖 B2，C2.統計數據A.FBXO2 mRNA表達 B.FBXO2蛋白表達 C.p - STAT3 / STAT3圖3 枸橘苷對U-2 OS細胞FBXO2表達和STAT3通路的影響1.Blank control group 2.Poncirin low-dose group 3.Poncirin high-dose groupB1，C1.Electrophoretogram B2，C2.Statistical dataA.Expression of FBXO2 mRNA B.Expression of FBXO2 protein C.p-STAT3/STAT3Fig.3 Effect of poncirin on the FBXO2 expression and STAT3 pathway in U-2 OS cells

慢病毒轉染細胞STAT3 通路：與B 組比較，A 組U-2 OS細胞中p-STAT3/ STAT3顯著降低（P＜0.05）；與C 組比較，D 組U-2 OS 細胞中p-STAT3/STAT3 顯著升高（P＜0.05）。詳見圖7。

3 討論

骨肉瘤是原發性骨癌的一種高分級形式，約20%的患者診斷時發現已轉移［7］。現臨床采用手術切除原發性腫瘤聯合化療，但約1/3的患者出現轉移性疾病［8］。

類黃酮屬多酚類化合物，包括黃烷酮類、黃烷醇類、花青素類、原花青素類、異黃酮類等成分［9］。枸橘苷屬富含黃烷酮的苷類物質，可通過介導胃癌細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用［10］。此外，枸橘苷可增強順鉑耐藥骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性，促進細胞凋亡［11］。自噬在腫瘤細胞遷移和侵襲、腫瘤干細胞維持、治療抵抗及腫瘤細胞與其微環境之間的交互作用中發揮了關鍵作用［12］。有研究表明，虎杖苷可顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖，增加其自噬通量；暴露于自噬抑制劑3- 甲基腺嘌呤后，虎杖苷誘導的細胞自噬顯著減弱，而細胞存活率升高［13］。本研究結果顯示，枸橘苷可抑制U-2 OS 細胞增殖，提高U-2 OS 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 蛋白的表達水平，抑制p62 蛋白表達水平的升高，提示枸橘苷可抑制U-2 OS細胞增殖并誘導細胞自噬。

b1.電泳圖 b2.統計數據a.FBXO2 mRNA表達 b.FBXO2蛋白表達圖5 U-2 OS細胞中FBXO2的表達b1.Electrophoretogram b2.Statistical dataa.Expression of FBXO2 mRNA b.Expression of FBXO2 proteinFig.5 Expression of FBXO2 in U-2 OS cells

a.顯微鏡視野 b.細胞克隆統計 c.細胞活力圖4 過表達FBXO2逆轉枸橘苷對U-2 OS細胞增殖的影響注：與B組比較，*P ＜0.05；與C組比較，#P ＜0.05。圖5至圖7同。a.Field of microscope b.Statistics data of clone cells c.Cell viabilityFig.4 Effect of poncirin on the proliferation of U-2 OS cells by the overexpression of FBXO2 reversesNote：Compared with those in group B，*P ＜0.05（for Fig.4-7）；Compared with those in group C，#P ＜0.05（for Fig.4-7）.

大多數F-box 蛋白通過調控參與腫瘤標志性途徑底物的表達，促進腫瘤細胞的生長、增殖、進展、轉移和侵襲［14］。FBXO2 屬F - box 蛋白家族，其高表達與大腸癌轉移和大腸癌細胞分期密切相關，是大腸癌患者的獨立預后因素［15］。在子宮內膜癌中，FBXO2表達的增強與腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤組織學類型及預后不良有關［16］。本研究結果顯示，枸橘苷可抑制FBXO2 的表達，提示枸橘苷可通過抑制FBXO2 的表達而抑制U-2 OS細胞的增殖，并誘導其自噬。

STATs是信號傳感器和轉錄激活因子，配體依賴的STATs 調節級聯激活，通常與細胞生長、分化的調節有關［17］。STAT 家族成員STAT3 信號通路能調節腫瘤細胞的增殖、生長和凋亡［18］。目前已有研究證明，可通過誘導細胞自噬抑制STAT3磷酸化，從而抑制腦腫瘤細胞的生長，并促進其凋亡［19］，激活STAT3 通路可促進U-2 OS細胞的增殖和轉移［20］。FBXO2 可通過激活STAT3 通路促進U-2 OS 細胞增殖［21］。本研究結果顯示，枸橘苷可抑制U-2 OS細胞中STAT3的磷酸化，提示枸橘苷可通過抑制FBXO2 表達而抑制STAT3 通路的激活，從而在骨肉瘤細胞中發揮抑制作用。

綜上所述，枸橘苷可抑制U-2 OS 細胞增殖，并促進其自噬，其機制可能與抑制FBXO2 表達從而抑制STAT3通路激活有關。

a.電泳圖 b.LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ c.Beclin1，p62蛋白表達圖6 過表達FBXO2逆轉枸橘苷對U-2 OS細胞自噬的影響a.Electrophoretogram b.LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰc.Expression of Beclin1 and p62 proteinsFig.6 Effect of poncirin on the autophagy of U-2 OS cells by the overexpression of FBXO2 reverses

a.電泳圖 b.p - STAT3 / STAT3圖7 過表達FBXO2逆轉枸橘苷對骨肉瘤細胞STAT3通路的影響a.Electrophoretogram b.p-STAT3/STAT3Fig.7 Effect of poncirin on the STAT3 pathway of osteosarcoma cells by the overexpression of FBXO2 reverses