葛根素對缺血性腦卒中模型大鼠神經損傷的防護作用*

于心洋，張賀齊，劉云平，尚淑玲

（河北省唐山市協和醫院神經內科，河北 唐山 063000）

保護神經細胞的結構和功能是促進腦卒中患者神經功能恢復的有效措施。研究顯示，典型Wnt/β-catenin信號通路能參與腦缺血及神經細胞死亡過程，與缺血性腦卒中的發生與發展關系密切［1］。通過干預Wnt/β-catenin 通路能促進腦卒中神經損傷的修復。葛根素具有擴張腦血管、改善微循環等作用，對腦卒中等腦血管疾病療效顯著［2］。有研究表明，葛根素能通過抑制神經細胞凋亡、調節自噬等途徑減輕腦缺血所致神經功能 損 傷［3-4］，而其神經保護作用 是 否 與Wnt / β -catenin 信號通路相關仍不明晰。本研究中觀察了葛根素對缺血性腦卒中模型大鼠神經損傷的防護作用，并探討其相關機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Mirofuge 20 R型低溫高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；Infinite M20 Pro型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；RM2245 型石蠟切片機、ChemTron KSW 型倒置光學顯微鏡（德國Leica公司）；EC3型基礎電泳儀、電轉儀、ChemiDocXRS+凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

試藥：葛根素注射液（華北制藥集團有限責任公司，批號為19120903，規格為每支0.2 g；臨用前用生理鹽水稀釋）；尼莫地平片（山東新華制藥股份有限公司，批號為2001032，規格為每片20 mg）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京索萊寶科技有限公司，批號為20200113）；尼氏（Nissl）染色試劑盒（上海生工生物工程有限公司，批號為0521S20）；神經元特異性烯醇化酶（NSE）、血清星形膠質源性蛋白（S100β）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（均購自南京森貝伽生物科技有限公司，批號分別為20200108，20200117）；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、磷酸化糖原合酶激酶3β（p-GSK3β）、β連環蛋白（β-catenin）、β-肌動蛋白（β-actin）鼠單克隆抗體（Santa Crutz 公司，批號分別為0106123，0104325，0103328，0102216）。

動物：SPF 級SD 大鼠90 只，雄性，8 周齡，體質量（200±20）g，由華北理工大學醫學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK（冀）2020 - 007。于溫度20～25 ℃、相對濕度50%～65%的環境中適應性飼養1 周。本實驗經唐山市協和醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模與給藥

將大鼠按體質量隨機分為空白對照組（等體積生理鹽水）、假手術組（等體積生理鹽水）、模型組（等體積生理鹽水）、尼莫地平組（12 mg/ kg）及葛根素低、高劑量組（50 mg/ kg，100 mg/ kg），各15 只。除空白對照組外，其余各組大鼠均采用血管內拴線阻斷法以復制缺血性腦卒中大鼠模型［5］。術前禁食12 h，腹腔注射水合氯醛（400 mg/ kg）麻醉，仰臥位固定，碘伏消毒頸部皮膚，于頸部正中縱行切開1 cm 切口，鈍性分離頸前肌肉，充分暴露左側頸總、頸內及頸外動脈，分離頸總動脈及迷走神經，并用4 號絲線結扎頸總動脈近心端，在距頸總動脈分支0.8～1.0 cm 處結扎頸外動脈，將頸總動脈遠心端用動脈夾暫時阻斷，在距頸總動脈及頸內動脈、頸外動脈分叉約5 mm 處剪一“V”型小口，將線栓插入頸內動脈，深度為16～18 mm 時可有輕微阻力感，隨后結扎頸總和頸內動脈遠心端，縫合切口，再次碘伏消毒。術后將大鼠置37 ℃恒溫箱以維持體溫。假手術組僅分離上述血管而不結扎。建模成功（Longa［6］得分1～4分）后，各組大鼠灌胃相應藥物或生理鹽水，每日1 次，持續14 d。空白對照組大鼠正常飼養，不予處理。

1.2.2 觀察指標

神經功能障礙：參照Longa 法［6］評判。0 分，無神經功能異常癥狀；1 分，提起鼠尾時大鼠缺血側前肢不能完全伸展；2 分，大鼠不能直行，行走時向對側轉圈；3 分，大鼠行走困難，行走時向對側傾斜；4分，大鼠出現意識障礙，無法自發行走。記錄術后6 h 及術后1，4，7，14 d大鼠的Longa評分。

腦梗死體積：末次給藥后，各組分別隨機選取5 只大鼠，腹腔注射水合氯醛（400 mg/ kg）麻醉后斷頭取腦，生理鹽水沖洗2 次后置濾紙上吸干，-20 ℃冰箱內冷凍20 min 后取出，沿冠狀面每隔2 mm 將大腦切成5片，置避光保存的0.2%TTC染液中，37 ℃孵育30 min，每5 min 翻動1 次。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，4%多聚甲醛溶液中固定24 h。取出大腦切片，吸干并拍照，用Image-Pro Plus 6.0 軟件測量并計算腦梗死體積。白色或未被染色區域為腦梗死組織。腦梗死體積（%）=腦梗死面積/腦切片面積×100%。

神經細胞形態學：末次給藥后，各組分別隨機選取5 只大鼠，腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，開胸，暴露心臟，用預冷的生理鹽水沖洗血液，灌注4%多聚甲醛PBS 溶液1 h，剝離腦組織，置4 %多聚甲醛溶液中，4 ℃冰箱中固定72 h，將腦組織沿冠狀面切成3 段，取中間含海馬段進行石蠟包埋，做5 μm 厚連續冠狀切片，并行Nissl 染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察海馬CA1區神經細胞形態學。

血清中NSE 和S100β 水平：采用ELISA 法檢測。末次給藥后，各組大鼠腹主動脈取血，3 000 r/min 離心，分離，得血清，置-20 ℃冰箱保存。取10 μL，加入樣品稀釋劑40 μL，抗體100 μL，加入樣品孔，置37 ℃溫箱孵育1 h，用洗滌液洗5 次。每孔加入底物液A、底物液B各50 μL 顯色，37 ℃溫箱中避光孵育15 min。加入終止液50 μL，于酶標儀450 nm波長處檢測各反應孔的光密度（OD）值，建立標準曲線，計算各樣本NSE 和S100β 的水平。

腦組織勻漿中GSK-3β，p-GSK-3β，β-catenin蛋白表達水平：采用Western blot法檢測。末次給藥后，各組分別隨機選取5只大鼠的海馬組織100～200 mg，剪碎后置RIPA裂解液中，冰上勻漿后12 000 r/min 離心20 min，提取總蛋白，BCA 法測定蛋白含量，進行制膠、上樣、電泳、轉膜和封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜；二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜。ECL發光液孵育，凝膠成像系統曝光后，計算OD值，檢測海馬腦組織勻漿中GSK-3β，p-GSK-3β，β-catenin的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評分

與假手術組比較，模型組大鼠Longa 評分明顯升高（P ＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平組及葛根素高劑量組術后4，7，14 d，葛根素低劑量組術后7 d 和14 d 的Longa評分均明顯降低（P ＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠術后Longa評分比較（±s，分，n=15）Tab.1 Comparison of postoperative Longa score of rats in each group（±s，point，n=15）

表1 各組大鼠術后Longa評分比較（±s，分，n=15）Tab.1 Comparison of postoperative Longa score of rats in each group（±s，point，n=15）

注：與假手術組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。表2、表3、圖3同。Note：Compared with those in the sham operation group，*P ＜0.05，**P ＜ 0.01（for Tab.1 - 3 and Fig.3）；Compared with those in the model group，#P ＜0.05，##P ＜0.01（for Tab.1-3 and Fig.3）.

組別空白對照組假手術組模型組尼莫地平組葛根素低劑量組葛根素高劑量組6 h 0 0 2.67±1.07**2.80±1.08 2.73±1.03 2.67±1.05 1 d 0 0 2.60±1.06**2.67±1.05 2.53±0.99 2.47±1.06 4 d 0 0 2.47±0.99**1.67±0.62#1.93±0.80 1.60±0.51#7 d 0 0 2.40±0.91**1.47±0.52#1.60±0.51##1.40±0.51#14 d 0 0 2.27±0.80**1.20±0.41##1.40±0.51##1.13±0.35##

2.2 腦梗死體積

空白對照組、假手術組大鼠腦組織中均未見梗死灶。模型組、尼莫地平組及葛根湯低、高劑量組可見不同程度腦組織壞死，尼莫地平組及葛根素低、高劑量組大鼠腦組織梗死體積較模型組顯著減小（P ＜0.05，P ＜0.01）。詳見圖1、表2。

2.3 腦組織神經細胞形態

空白對照組及假手術組大鼠海馬CA1 區神經細胞排列整齊，密度高，尼氏體豐富；模型組大鼠神經細胞損傷明顯，可見細胞間隙擴大，結構紊亂，細胞核固縮，尼氏體數量減少；尼莫地平組及葛根素低、高劑量組大鼠神經細胞排列較規律，異常神經細胞數量較模型組明顯減少，尼氏體數量增加，神經細胞形態明顯改善。詳見圖2。

2.4 血清中NSE 和S100β 水平

與假手術組比較，模型組大鼠血清中NSE 和S100β水平均明顯升高（P ＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平組及葛根素低、高劑量組大鼠的NSE和S100β水平均顯著降低（P ＜0.05，P ＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠腦梗死體積及NSE和S100β水平比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of cerebral infarction volume，NSE and S100β levels in each group（±s，n=5）

表2 各組大鼠腦梗死體積及NSE和S100β水平比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of cerebral infarction volume，NSE and S100β levels in each group（±s，n=5）

組別空白對照組假手術組模型組尼莫地平組葛根素低劑量組葛根素高劑量組劑量（mg/kg）12 50 100梗死體積（%）0 0 22.75±4.85**15.08±3.28##18.43±2.96#14.51±2.41##NSE（ng/mL）0.64±0.09 0.74±0.18 4.53±0.86**2.23±0.47##3.37±0.95#2.01±0.52##S100β（pg/mL）30.19±8.38 32.23±5.95 133.49±20.41**76.80±10.56##95.14±28.80##72.63±12.28##

A.空白對照組 B.假手術組 C.模型組 D.尼莫地平組E.葛根素低劑量組 F.葛根素高劑量組圖1 大鼠腦組織病理形態（TTC）A.Blank control group B.Sham operation group C.Model group D.Nimodipine group E.Puerarin low-dose group F.Puerarin highdose groupFig.1 Pathological morphology of rats′ brain tissue（TTC staining）

2.5 海馬組織GSK - 3β，p - GSK - 3β，β - catenin蛋白表達水平

與假手術組比較，模型組大鼠GSK - 3β 的蛋白表達水平顯著升高，p-GSK-3β 和β-catenin 的蛋白表達水平均顯著降低（P ＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平組及葛根素低、高劑量組大鼠GSK - 3β 的表達水平顯著降低（P ＜0.01），p - GSK - 3β 和β - catenin 表達水平均顯著升高（P ＜0.01）。詳見圖3。

3 討論

腦血管疾病是中老年人的常見病及多發病，也是全球人類第二大死因，近年來發病率呈明顯上升趨勢［7］。該病以腦卒中為主，尤以缺血性腦卒中最常見，腦卒中可導致腦供血不足，腦組織壞死，并引起腦神經功能損傷的臨床癥狀和體征［8］。發病早期，局部神經細胞的電活動停止，而細胞結構基本完好，盡早恢復血供，仍可恢復神經功能，隨著缺血時間的延長，腦膠質細胞及局部微血管增生，進而導致腦組織水腫，神經細胞變性、壞死［9］。保護神經細胞的結構和功能，是促進腦卒中患者神經功能恢復的有效措施。

Wnt/β-catenin信號通路在細胞增殖、凋亡、衰老等多種生理病理過程中發揮重要調控作用［10］。Wnt/β-catenin通路能參與腦缺血及缺血所致神經細胞損傷、壞死過程，與缺血性腦卒中的發生與發展關系密切［11］。其中，GSK - 3β 的調節起主導作用。GSK - 3β 為Wnt 通路下游的負調控因子，參與細胞凋亡，炎性反應，神經細胞極性等多種細胞生理病理過程的調控，并能通過調節下游蛋白β - catenin 維持細胞核質的穩定性［12-13］。在大鼠腦缺血- 再灌注模型中，PI3K/ Akt 信號能通過GSK-3β調節β-catenin的表達［14］。腦缺血-再灌注損傷模型小鼠Wnt/ β - catenin 通路被激活，增加了β -catenin 的表達［15］。WANG 等［16］研究發現，腦卒中模型小鼠缺血局部神經干細胞中β -catenin 的表達水平降低，經過GSK-3β 抑制劑TWS119處理后，GSK-3β的蛋白表達被抑制，β - catenin 的表達水平升高，同時增加了腦卒中區域神經干細胞的數量及活性，促進了神經修復。表明Wnt/ β - catenin 信號通路參與腦卒中神經細胞的死亡過程，通過干預Wnt/β-catenin 通路將有助于腦卒中神經損傷的修復。

a1.GSK-3β a2.p-GSK-3β a3.β-catenin a1-a3.數據統計 b.電泳圖A.空白對照組 B.假手術組 C.模型組 D.尼莫地平組 E.葛根素低劑量組 F.葛根素高劑量組圖3 大鼠腦組織勻漿中GSK-3β，p-GSK-3β，β-catenin的蛋白表達水平a1.GSK-3β a2.p-GSK-3β a3.β-catenin a1-a3.Data statistics b.ElectrophoretogramA.Blank control group B.Sham operation group C.Model group D.Nimodipine group E.Puerarin low-dose group F.Puerarin high-dose groupFig.3 Expression level of GSK-3β，p-GSK-3β and β-catenin protein in hippocampus of rats

A.空白對照組 B.假手術組 C.模型組 D.尼莫地平組 E.葛根素低劑量組 F.葛根素高劑量組圖2 大鼠腦組織神經細胞形態學（Nissl，×400）A.Blank control group B.Sham operation group C.Model group D.Nimodipine group E.Puerarin low-dose group F.Puerarin high-dose groupFig.2 Morphology of nerve cells in rats′ brain tissue（Nissl staining，× 400）

中藥在腦卒中的預防及急性期、恢復期的臨床治療中得到了廣泛應用，其所含多種有效成分，可通過多途徑、多靶點綜合作用，防護腦缺血損傷，且更有助于作用機制的研究。葛根素為葛根中的一種異黃酮類單體，具有擴張腦血管、改善微循環等作用，對腦卒中、動脈粥樣硬化等腦血管疾病有益［17-18］。葛根素能顯著抑制腦卒中大鼠海馬組織中人半胱氨酸蛋白酶- 3（cas‐pase - 3）的活性，通過抑制神經細胞凋亡發揮神經細胞保護作用［6］。黃亞光等［4］的研究表明，葛根素能通過抑制細胞自噬，減輕腦缺血- 再灌注大鼠的神經功能損傷。然而其神經保護作用是否與Wnt/β-catenin 信號通路相關尚不明晰。

本研究結果顯示，葛根素能顯著改善模型大鼠的神經功能，減小腦梗死體積，并改善大鼠海馬CA1 區神經細胞損傷。S100β 在生理狀況下不能通過血腦屏障，腦損傷發生后，其過度表達和釋放使血清中的S100β水平迅速上升，根據其升高的幅度可判斷腦損傷的嚴重程度［19］。NSE 僅存在于神經細胞的胞漿中，其分泌水平與神經細胞的死亡量呈顯著正相關，是神經細胞損傷的敏感生化指標［20］。ELISA 檢測結果顯示，葛根素不同劑量組大鼠血清中NSE 和S100β 的水平均較模型組顯著降低，提示葛根素能減輕模型大鼠的神經細胞損傷，對模型大鼠的神經功能具有明顯改善作用。Western blot檢測結果顯示，模型組大鼠腦組織勻漿中GSK-3β的表達水平較假手術組明顯升高，p - GSK - 3β 和β - catenin 的表達水平均顯著降低；與模型組比較，葛根素不同劑量組大鼠GSK-3β 的蛋白表達水平明顯降低，p-GSK-3β 和β-catenin 的蛋白表達水平均明顯上升。

綜上所述，葛根素能顯著改善缺血性腦卒中模型大鼠的神經功能，減輕大鼠神經細胞損傷，其作用機制可能與調節Wnt/β-catenin 信號通路相關。