瑤藥大豬屎豆質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

唐炳蘭，莫單丹，龔小妹，歐春麗，王 碩，周小雷，趙以民

（廣西壯族自治區(qū)藥用植物園·廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室·廣西壯族自治區(qū)中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心，廣西 南寧 530023）

大豬屎豆為豆科植物大豬屎豆Crotalaria assamicaBenth.的全株，別名自消容、十字珍珠草等［1］，在廣西主要分布于南寧、平樂、蒼梧等地［2］。大豬屎豆全株均可入藥，味淡，性微涼，具有清熱解毒、止血消腫、涼血降壓、利水功效，可用于治療黃疸型肝炎、咳嗽吐血、牙痛、小兒頭瘡、高血壓、跌打損傷、外傷出血等癥［3］。瑤族民間將該藥材稱為“定心榕”，主要用于治療心慌、心悸等癥。大豬屎豆主要含有生物堿、鞣質(zhì)、有機酸等化學(xué)成分，其主要活性成分為野百合堿。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，野百合堿具有明顯的抗腫瘤作用，對人體肝癌細胞株BEL - 7402、人口腔表皮樣癌細胞等均有顯著抑制作用［4-5］；對鱗狀上皮癌、宮頸癌和白血病的近期療效較好，但有一定肝毒性［6-7］；同時可引起肺動脈高壓和右心室肥大等毒副作用，在實驗研究中可作為建立肺動脈高壓和右心室心肌肥厚模型的誘導(dǎo)劑［8-9］。大豬屎豆莖葉急性毒性弱，屬無毒級食品，但其種子急性毒性作用較強［10-11］。既往對大豬屎豆的研究主要集中在性狀、顯微鑒別［12］及含量測定［13］方面。本研究中在對大豬屎豆進行性狀、顯微鑒別基礎(chǔ)上增加了薄層色譜（TLC）鑒別，以及水分、總灰分、浸出物含量的測定，可為該藥材的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH - 6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；CP2250D 型電子分析天平（德國Sarto‐rius 公司）；Milli - Q Academic 型超純水儀（美國Milli‐pore 公司）；DZTW 型調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；RM225 型石蠟切片機、DM2000 型生物醫(yī)療顯微鏡，均購自德國Leica 公司。

1.2 試藥

硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司，批號為20161102，規(guī)格為50 mm×100 mm）；試劑均為分析純，水為超純水；大豬屎豆藥材樣品（經(jīng)本藥用植物園趙以民副研究員鑒定為正品），藥用部位均為全株，樣品信息見表1；以樣品ZSD-3 作為大豬屎豆對照藥材（經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授及廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥教授和黃云峰副研究員鑒定為正品）。

表1 大豬屎豆藥材樣品信息Tab.1 Information of Crotalaria assamica samples

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

肉眼觀察，可見藥材樣品莖枝直徑4～8 mm，有稍凸起之縱棱。葉多破碎，上面呈灰褐色或灰綠色，背面呈灰色。枝上可見宿存的小托葉，色黃，貼于葉柄下兩旁；種子呈腎形，兩側(cè)面飽滿或呈凹窩狀，長3～5 mm，寬約3 mm，表面黃綠色、黑綠色或黑色，光滑，有光澤；腹面深凹陷，為種臍著生處。質(zhì)堅硬，不易破碎。氣微，味淡。詳見圖1。

圖1 藥材外觀Fig.1 Pictures of Crotalaria assamica

2.2 顯微鑒別

莖橫切面：置顯微鏡下觀察，可見表皮為單列細胞，呈近圓形或矩形的不規(guī)則多邊形，排列緊密，外被角質(zhì)層，氣孔可見。皮層細胞多列，有淀粉鞘，細胞直徑15～24 μm。維管束斷續(xù)成環(huán)，木質(zhì)部較韌皮部厚，形成層明顯，維管束內(nèi)導(dǎo)管細胞單個或多個聚集，呈放射狀排列。髓部細胞較大，常見有草酸鈣晶體。詳見圖2。

1.氣孔 2.表皮 3.皮層 4.維管束 5.髓部 6.髓腔7.韌皮部 8.形成層 9.木質(zhì)部 10.淀粉鞘 11.草酸鈣簇晶圖2 莖橫切面顯微圖1.Stoma 2.Epidermis 3.Cortex 4.Vascular bundle 5.Pith 6.Medullary cavity 7.Phloem 8.Cambium 9.Xylem 10.Starch sheath 11.Calcium oxalate cluster crystalFig.2 Micrograph of transverse section of stem of Crotalaria assamica

2.3 粉末特征

取藥材樣品粉末適量，置顯微鏡下觀察，可見纖維多成束或單個散在，有的纖維壁薄；多見單細胞非腺毛，壁薄，部分壁厚，上有疣狀突起，直徑5～20 μm，長100～150 μm，少見2個細胞的非腺毛；導(dǎo)管以螺紋導(dǎo)管和具緣紋孔多見，直徑25～50 μm；花粉粒呈圓球狀；木栓細胞呈多邊形，氣孔為橢圓形，呈平軸式；草酸鈣簇晶呈團塊狀存在。詳見圖3。

2.4 水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量測定

按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0832 水分測定法中烘干法進行水分測定，按通則2302 灰分測定法進行總灰分、酸不溶性灰分含量測定，按通則2201浸出物測定法中冷浸法進行浸出物含量測定。結(jié)果見表2。故擬訂該藥材水分為不得過13.00%，總灰分不得過10.00%，酸不溶性灰分不得過0.40%，醇浸出物不得低于6.00%。

表2 藥材樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定結(jié)果（%）Tab.2 Determination results of moisture，total ash，acid insoluble ash and extract of Crotalaria assamica samples（%）

2.5 TLC 鑒別［14-15］

取藥材樣品粉末2 g，加95%乙醇50 mL，超聲（功率為200 W，頻率為40 kHz）處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL 使溶解，用醋酸乙酯提取2次，各10 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，即得供試品溶液。取對照藥材粉末2 g，同供試品溶液制備方法制成對照品溶液。精密吸取上述2 種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇（20∶2∶1∶0.2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點。詳見圖4。

1.纖維束2.草酸鈣簇晶 3.非腺毛 4.氣孔 5.花粉粒6.導(dǎo)管 7.木栓細胞圖3 粉末顯微圖1.Fiber bundle 2.Calcium oxalate cluster crystal 3.Non-glandular hair 4.Stoma 5.Pollen grain germination 6.Vessel 7.Cork cellFig.3 Micrograph of the powder of Crotalaria assamica

3 討論

1，6，10.ZSD-3 2.ZSD-1 3.ZSD-2 4.ZSD-4 5.ZSD-5 7.ZSD-6 8.ZSD-7 9.ZSD-8 11.ZSD-9 12.ZSD-10圖4 薄層色譜圖1，6，10.ZSD-3 2.ZSD-1 3.ZSD-2 4.ZSD-4 5.ZSD-5 7.ZSD-6 8.ZSD-7 9.ZSD-8 11.ZSD-9 12.ZSD-10Fig.4 TLC chromatograms

預(yù)試驗中，分別比較了TLC 鑒別的石油醚- 醋酸乙酯- 甲醇（10∶1∶0.5，V/V/V）、石油醚- 三氯甲烷-甲醇（10∶1∶1，V/V/V）、石油醚-三氯甲烷-醋酸乙酯- 甲醇（20∶1∶1∶0.5，V/V/V/V）、石油醚- 三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇（20∶2∶1∶0.2，V/V/V）等展開系統(tǒng)，結(jié)果以最后一種為展開劑時得到的薄層色譜斑點清晰，分離效果較好；并同時考察了不同廠家的硅膠板，不同展開溫度和濕度對展開結(jié)果的影響。結(jié)果不同的薄層板、溫度和濕度對展開結(jié)果影響不大，說明該薄層鑒別方法耐用性較好。本研究中還分別考察了60%，70%，80%，90%乙醇和水5種提取溶劑對藥材樣品浸出物提取量的影響，結(jié)果使用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液提取，其浸出物含量不同（水溶性大于醇溶性），低體積分?jǐn)?shù)的乙醇浸出物含量較多，為降低藥材無效成分的溶出度，重點兼顧富集大豬屎豆生物堿、酚類、香豆素類、甾體類、三萜類脂溶性和水溶性等主要活性成分，故本研究中浸出物測定選擇70%乙醇作為提取溶劑。

綜上所述，本研究中所建立的方法操作簡便，結(jié)果可靠，穩(wěn)定性好，可用于大豬屎豆藥材的質(zhì)量控制。