柴葶寧肺顆粒質量標準研究*

楊仁耐，吳紅燕，李慧媛，王舉濤，2，劉勁松△

（1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012； 2.中藥研究與開發安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012）

柴葶寧肺顆粒由柴胡、葶藶子、黃芩、白芍、鉤藤、全瓜蔞、姜半夏、地龍、烏梅、丹參、甘草等15 味中藥材組方，具有調肝理肺、止咳平喘等功效，主治支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病。原方劑為湯劑，存在服用量大、攜帶不方便等缺點，現按傳統工藝，經水提取后研制成方便服用、易攜帶的口服顆粒劑，既遵循傳統中藥復方的經驗，又盡可能保留處方中藥材的有效成分，確保療效。本研究中采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別制劑中的丹參、白芍、黃芩、鉤藤，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中芍藥苷、黃芩苷、丹酚酸B、甘草酸、漢黃芩素的含量，以為柴葶寧肺顆粒質量標準的建立提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ULtiMate 3000 型色譜系統（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；AUW220D 型十萬分之一電子天平（日本Shimadzu 公司）；FA2004B 型萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；JK - 250DB 型超聲儀（合肥金尼克機械制造有限公司）。

1.2 試藥

柴葶寧肺顆粒（淮北市中醫醫院制劑室，批號分別為20201001，20201002，20201003）；丹酚酸B 對照品（批號為DST190918-009，含量≥98%），芍藥苷對照品（批號為MUST - 16041901，含量≥99%），黃芩素對照品（批號為DST191012-024，含量≥98%），漢黃芩素對照品（批號為DST191023-025，含量≥98%），均購自成都德斯特生物技術有限公司；黃芩苷對照品（批號為110715-201318，含量≥93%），甘草酸銨對照品（批號為110731-201619，含量≥93%），丹參對照藥材（批號為120923 - 201816），白芍對照藥材（批號為120905 -201610），黃芩對照藥材（批號為120955 - 201810），鉤藤對照藥材（批號為121190 - 201204），均購自中國食品藥品檢定研究院；聚胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；硅膠G 薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

丹參［1-2］：取丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為1 mg/mL 的對照品溶液。取丹參對照藥材1 g，加50 mL 水，煮20 min，濾過，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，即得丹參對照藥材溶液。取樣品內容物10 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲（功率為200 W，頻率為50 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液蒸干后加水10 mL 使溶解，用乙醚萃取2次（每次10 mL），合并有機相，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，即得供試品溶液。按柴葶寧肺顆粒處方和工藝制備缺丹參的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述4 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯- 三氯甲烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 甲酸（2∶3∶4∶2∶0.5，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

1-3.供試品溶液 4.對照藥材溶液 5.對照品溶液6.陰性對照品溶液A.丹參 B.白芍圖1 丹參和白芍的薄層色譜圖1 - 3.Test solution 4.Reference material solution 5.Reference solution 6.Negative reference solutionA.Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizome B.Paeoniae Radix AlbaFig.1 TLC chromatograms of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizome and Paeoniae Radix Alba

白芍［2-3］：取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為1 mg/mL 的對照品溶液。取白芍對照藥材1 g，加50 mL 水，煮20 min，濾過，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，即得白芍對照藥材溶液。取樣品內容10 g，置具塞錐形瓶中，加無水乙醇50 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干后加甲醇1 mL 使溶解，即得供試品溶液。按柴葶寧肺顆粒處方和工藝制備缺白芍的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述4 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

黃芩［4］：取黃芩素和漢黃芩素對照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成質量濃度為0.5 mg/mL 的單一對照品溶液。取黃芩對照藥材1 g，加50 mL水，煮20 min，濾過，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，即得黃芩對照藥材溶液。取樣品內容物10 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干后加水10 mL使溶解，加稀鹽酸調pH 至1～2，濾過，濾液用乙酸乙酯10 mL振搖提取，分取有機相，水浴蒸干，加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。按柴葶寧肺顆粒處方和工藝制備缺黃芩的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述5 種溶液各5 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯- 乙酸乙酯- 甲醇- 甲酸（10∶3∶2.5∶0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴三氯化鋁試液檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖2 A。

鉤藤［5］：取鉤藤堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為1 mg/mL 的對照品溶液。另取鉤藤對照藥材1 g，加50 mL 水，煮20 min，濾過，水浴蒸干，加甲醇1 mL使溶解，即得鉤藤對照藥材溶液。取樣品內容物10 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干后加5%氫氧化鈉溶液10 mL 使溶解，用三氯甲烷萃取2 次（每次10 mL），合并有機相，水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解，即得供試品溶液。按柴葶寧肺顆粒處方和工藝制備缺鉤藤的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述4 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮-氨水（3∶3∶2∶0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖2 B。

1.黃芩素對照品溶液 2.漢黃芩素對照品溶液 3.鉤藤堿對照品溶液 4.對照藥材溶液 5-7.供試品溶液 8.陰性對照品溶液A.黃芩 B.鉤藤圖2 黃芩和鉤藤的薄層色譜圖1.Reference solution of baicalein 2.Reference solution of wogonin 3.Reference solution of rhynchophylline 4.Reference material solution 5-7.Test solution 8.Negative reference solutionA.Scutellariae Radix B.Uncariae Ramulus cum UncisFig.2 TLC chromatograms of Scutellariae Radix and Uncariae Ramulus cum Uncis

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Tabitha RZ - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時10%A→15%A，10～20 min 時15%A→20%A，20～50 min 時20%A→29%A，50～60 min 時29%A→50%A，60 ～70 min 時50%A→15%A）；流速：1 mL / min；檢測波長：245 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.芍藥苷 2.黃芩苷 3.丹酚酸B 4.甘草酸 5.漢黃芩素A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.缺甘草的陰性對照品溶液 D.缺白芍的陰性對照品溶液 E.缺丹參的陰性對照品溶液F.缺黃芩的陰性對照品溶液圖3 高效液相色譜圖1.Paeoniflorin 2.Baicalin 3.Salvianolic acid B 4.Glycyrrhizic acid 5.WogoninA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Glycyrrhizae Radix et Rhizoma D.Negative reference solution lacking Paeoniae Radix Alba E.Negative reference solution lacking Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizome F.Negative reference solution lacking Scutellariae RadixFig.3 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含芍藥苷130.14 μg、黃芩苷148.53 μg、丹酚酸B 94.86 μg、甘草酸12.76 μg、漢黃芩素12.54 μg 的混合對照品溶液。取樣品內容物1.0 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，超聲處理30 min，放冷，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按柴葶寧肺顆粒處方和工藝分別制備缺白芍、缺黃芩、缺丹參、缺甘草的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成相應陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2.2 項下3 種溶液各適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陰性對照品溶液與混合對照品溶液色譜中相同保留時間處均無干擾峰，表明方法專屬性良好。詳見圖3。

線性關系考察：分別精密量取2.2.2項下混合對照品溶液1，2，4，6，8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。取10 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍（n=5）Tab.1 Regression equations and linear ranges（n=5）

精密度試驗：取2.2.2 項下供試品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果芍藥苷、黃芩苷、丹酚酸B、甘草酸、漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.01%，0.85%，1.05%，1.18%，1.26%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，16 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果芍藥苷、黃芩苷、丹酚酸B、甘草酸、漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.84%，1.02%，0.87%，1.23%，0.75%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置16 h內基本穩定。

重復性試驗：精密稱取樣品（批號為20201001）適量，各6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果芍藥苷、黃芩苷、丹酚酸B、甘草酸、漢黃芩素 的 平 均 含 量 分 別 為3.047 8，5.705 1，1.103 8，0.121 2，0.078 8 mg/ g，RSD分別為0.87%，1.64%，1.17%，0.43%，1.66%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20201001）適量，共9份，分別加入一定質量濃度的對照品溶液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率，結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Result of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of five components in the samples（mg/g，n=3）

3 討論

柴葶寧肺顆粒組方中，柴胡主歸肝、膽經，性寒，主升散；葶藶子主歸肺、膀胱經，大寒之品，主降，臨床用于痰多阻肺、咳嗽、呃逆等證，二者共為君藥。黃芩、全瓜蔞、姜半夏三藥均可調節胸悶、疏理氣機、除熱化痰，對咳嗽等呼吸道疾病有良好療效［6］；鉤藤味甘，性寒，歸肝經，能清熱、平熄肝風；地龍味咸，性寒，入肝、肺二經，平肝活絡，清肺平喘；白芍養血斂陰、柔肝止痛；烏梅平肝斂肺化陰、生津，同時烏梅白芍相伍可有效抑制柴胡升發太過，耗氣傷陰［7］，七藥合用，共助君藥調理肝肺，為臣藥。甘草味甘，性平，有調和諸藥功效，為使藥［8-9］。

參考2020年版《中國藥典（一部）》及相關文獻，對組方中各藥味進行TLC 摸索，發現柴胡、葶藶子、全瓜蔞、姜半夏、地龍、烏梅的TLC 色譜均存在陰性干擾［10-12］，或供試品中未見相同斑點的情況，故暫未列入質量標準，有待進一步研究。方中丹參TLC 鑒別時，由于制劑處方制備工藝為水煎煮，丹參酮ⅡB為脂溶性成分，故選擇丹酚酸B作為鑒別指標。供試品制備采用乙醇超聲處理時，雜質點多，分離效果不佳。采用甲醇超聲后用乙醚萃取，結果斑點清晰，無干擾。黃芩TLC 鑒別時，先采用操作簡單的GF254板，紫外下檢視，結果顯示供試品斑點較多、分離度及點的成型性均較差。優化后采用聚酰胺薄膜，同一展開系統下展開，三氯化鋁顯色后，斑點清晰、分離度好。鉤藤TLC 鑒別時，首先按藥典方法采用石油醚- 丙酮為展開系統，但展開及分離度均欠佳，后將展開系統換成甲苯-三氯甲烷-丙酮-氨水，結果斑點清晰，分離度好。

藥理學研究表明，黃芩苷、漢黃芩素可有效緩解機體咳喘，延長咳喘潛伏期，可治療咳喘［12-13］。甘草酸在預防和治療肺纖維化及支氣管炎等方面效果顯著［14］。白芍具有抗炎、調節免疫、保肝等藥理活性。芍藥苷是白芍中主要的活性物質［15］，可顯著抑制模型小鼠肺部炎癥、哮喘模型小鼠氣道炎癥［16］，芍藥甘草湯具有平喘和抗過敏作用［17］。丹參在治療小兒重癥肺炎、慢性阻塞性肺疾病有顯著療效［18-19］。故選擇上述5 種成分作為多指標含量測定指標。

預試驗中分別以乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈- 0.2%磷酸水溶液、甲醇- 水（梯度洗脫）作為流動相，結果采用乙腈- 0.1%磷酸水溶液時，色譜峰分離效果好，峰形最佳。選擇供試品溶液提取溶劑時，將50%甲醇、70%甲醇、甲醇作對比，結果甲醇提取效率最高。預試驗結果表明，同一波長下70 min 內5 種有效成分的分離效果和峰形均良好［20-21］。

綜上所述，本研究中建立的方法可用于柴葶寧肺顆粒的質量控制。