高效液相色譜法同時測定沈陽紅藥膠囊中4 種有效成分含量

王 婧

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222000）

沈陽紅藥膠囊由三七、川芎、白芷、當(dāng)歸、土鱉蟲、紅花、延胡索7味中藥組方，具有活血止痛、祛瘀生新功效，可治跌打損傷、筋骨腫痛等癥。三七為方中君藥，廣泛應(yīng)用于治療跌打損傷、瘀滯腫痛等癥［1］。三七皂苷R1為其主要有效成分，能止血止痛、滋補、抗疲勞、增強免疫力［2］。川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效［3］，主要含阿魏酸、川芎嗪、苯酚類化合物等酚酸、有機酸、生物堿等成分［4-5］。川芎除有行氣活血功效外，還對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定鎮(zhèn)靜作用［6］，并能抑制大腸桿菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌等菌種的活性，具有明顯的抗菌效力［7-9］。當(dāng)歸主要含有揮發(fā)油、有機酸、黃酮類等化學(xué)成分［10］，所含阿魏酸可抑制血小板聚集和血栓形成［11-12］。白芷所含以歐前胡素和異歐前胡素為代表的香豆素類化合物是其鎮(zhèn)痛的主要成分［3，13］。沈陽紅藥膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2020 年版《中國藥典（一部）》［3］，僅采用高效液相色譜（HPLC）法測定了人參皂苷Rg1含量。三七皂苷R1、阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素是該制劑中相應(yīng)藥材的主要有效成分，本研究中采用波長切換-HPLC 法同時測定沈陽紅藥膠囊中這些成分含量，旨在為該制劑的質(zhì)量評價提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、G4212B 二極管陣列檢測器、Agilent Chemstation 色譜工作站［安捷倫科技（中國）有限公司］；BT125D 型電子天平（精度為十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）；SYWQ800型超聲波清洗器（山東申儀電子科技有限公司）。

1.2 試藥

沈陽紅藥膠囊（沈陽紅藥集團股份有限公司，批號分別為190102，190201，190502）；阿魏酸對照品（批號為110773 - 201614，含量為99.0%），三七皂苷R1對照品（批號為110745-201619，含量為95.0%），歐前胡素對照品（批號為110826-201616，含量為99.6%），異歐前胡素對照品（批號為110827-201611，含量為99.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸、三乙胺均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸（A，用三乙胺調(diào)pH 至3.0）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：316 nm（0～18 min）、203 nm（18～22 min）、249 nm（22～90 min）；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

2.2 溶液制備

取阿魏酸、三七皂苷R1、歐前胡素、異歐前胡素對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成含阿魏酸1.157 mg/mL、三七皂苷R12.253 mg/mL、歐前胡素0.792 2 mg/mL、異歐前胡素0.336 4 mg/ mL 的單一對照品貯備液。精密量取阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素單一對照品貯備液各1 mL 及三七皂苷R1對照品貯備液10 mL，置同一100 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成阿魏酸、三七皂苷R1、歐前胡素、異歐前胡素質(zhì)量濃度分別為11.57，225.3，7.922，3.364 μg/ mL 的混合對照品溶液。取樣品內(nèi)容物，混勻，取約2.5 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇適量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理45 min，放冷至室溫，用70%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按沈陽紅藥膠囊處方和工藝分別制備缺三七、川芎、當(dāng)歸、白芷的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰。結(jié)果阿魏酸、三七皂苷R1、歐前胡素、異歐前胡素峰均與其他成分峰達到基線分離，陰性對照無干擾。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對照品溶液2，4，8，10，12，16 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進行線性回歸。得回歸方程，阿魏酸為Y1=5.249 2X1-4.889 1（r1= 0.999 8），三七皂苷R1為Y2= 0.309 8X2-6.054 7（r2= 0.999 7），歐前胡素為Y3= 4.761 3X3+1.649 3（r3= 0.999 9），異歐前胡素為Y4= 3.907 1X4-2.447 3（r4=0.999 3）。結(jié)果表明，阿魏酸、三七皂苷R1、歐前胡素、異歐前胡素進樣量分別在0.023 1～0.185 μg、0.451～3.60μg、0.0158～0.127μg、0.00673～0.0538μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限考察：分別精密量取2.2 項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比10∶1 時的進樣量作定量限。結(jié)果阿魏酸、歐前胡素、異歐前胡素定量限分別為0.462 8，0.660 2，1.682 0 ng。

1.阿魏酸 2.三七皂苷R1 3.歐前胡素 4.異歐前胡素A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.缺三七的陰性對照品溶液 D.缺川芎、當(dāng)歸的陰性對照品溶液 E.缺白芷的陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Ferulic acid 2.Notoginsenoside R1 3.Imperatorin 4.IsoimperatorinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Notoginseng Radix et Rhizoma D.Negative reference solution lacking Chuanxiong Rhizoma and Angelicae Sinensis Radix E.Negative reference solution lacking Angelicae Dahuricae RadixFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸、三七皂苷R1、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.69%，0.51%，0.79%，0.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液，分別于室溫放置0，4，8，12，18，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸、三七皂苷R1、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD分別為1.21%，1.46%，1.12%，1.17%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為190102）內(nèi)容物適量，各6份，每份2.5 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果阿魏酸、三七皂苷R1、歐前胡素、異歐前胡素的平均含量分別為0.228 4，3.456，0.131 6，0.061 17 mg/g，RSD分別為0.41%，0.50%，0.84%，0.80%（n=6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為190102）內(nèi)容物6份，每份約1.25 g，精密稱定，分別加入一定質(zhì)量濃度的單一對照品貯備液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品內(nèi)容物各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of four active ingredients in the samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 測定波長選擇

考察檢測波長時，使用DAD檢測器在200～400 nm范圍內(nèi)掃描光譜圖，結(jié)果阿魏酸在316 nm 波長處、三七皂苷R1在203 nm 波長處、歐前胡素和異歐前胡素在249 nm波長處有最大吸收，故選擇上述波長作為4個有效成分的檢測波長。

3.2 流動相考察

反相液相色譜體系中流動相通常為甲醇- 水、乙腈-水體系，為了使待測組分得到較好的分離效果，預(yù)試驗中考察了水-乙腈、0.1%磷酸（用三乙胺調(diào)pH 至6.0 或3.0）-乙腈3 個流動相體系。前兩者導(dǎo)致供試品所得圖譜基線不平穩(wěn)，色譜峰分離效果較差，或圖譜基線平穩(wěn)，色譜峰間分離度較好，但圖譜中阿魏酸峰未顯現(xiàn)。以后者為流動相時，圖譜基線平穩(wěn)，4 種有效成分均顯現(xiàn)，且與相鄰色譜峰分離度較好，因此選擇0.1%磷酸（用三乙胺調(diào)pH至3.0）-乙腈體系為流動相。

3.3 進樣量考察

供試品溶液進樣量會影響圖譜中各成分色譜峰的紫外吸收效果及分離效能，當(dāng)供試品溶液進樣量為5 μL 時，4 種有效成分的色譜峰紫外吸收強度較弱，尤其對異歐前胡素峰影響最大；供試品溶液進樣量為20 μL 時，其色譜圖中各成分紫外響應(yīng)值較大，但部分組分色譜峰與相鄰色譜峰不能完全分離，分離度小于1.5；當(dāng)供試品溶液進樣量為10 μL 時，其色譜圖中基線平穩(wěn)、色譜峰紫外響應(yīng)值較大，4 種有效成分與相鄰色譜峰分離度較好，因此選擇10 μL作為進樣量。

3.4 提取方式和提取時間考察

預(yù)試驗中考察了提取溶劑為70%甲醇時，加熱回流和超聲處理2 種提取方式對結(jié)果的影響，結(jié)果上述2 種提取方式所得結(jié)果無明顯差異，但超聲處理更方便快捷，故選擇超聲處理。

對供試品溶液的提取時間進行了考察，分別超聲處理30，45，60 min。結(jié)果超聲處理45 min 后，4 種有效成分基本提取完全，故選擇45 min。

綜上所述，本研究中建立的方法準(zhǔn)確、專屬性強，可用于同時測定沈陽紅藥膠囊中4種有效成分的含量。