益母草堿基由CaMKⅡ/Cx36信號對七氟醚誘導幼鼠突觸可塑性的改善作用

肖志博 金輝 謝海 符少川 葛樹勝

認知功能損傷是幼兒術后常見并發癥，如何保護患者避免損傷一直是研究重點。益母草堿 (Leonurine,SCM-198,Leo) 是益母草中提取分離的生物堿，研究顯示Leo是一種增強 BDNF/TrkB/CREB 信號傳導并促進神經元存活的藥物，對阿爾茲海默病模型小鼠行為學和生化指標具有正向調節作用[1]。此外，Leo可通過 c-Jun N 末端激酶途徑發揮抗氧化作用，減輕腦出血中的水腫和神經炎癥[2]。因此，Leo具有明顯的中樞神經保護作用，然而，Leo對七氟醚麻醉幼鼠認知功能的保護作用和潛在的分子靶點仍不清楚。哺乳動物腦組織中，神經元之間的縫隙連接與其旁路蛋白形成了類似化學突觸的“電突觸”，維持了神經元活動的閾上和閾下同步，成為突觸回路中重要組成部分?？p隙連接的分子底物是連接蛋白36 (connexin 36,Cx36)，其表達受鈣調蛋白激酶 Ⅱ (calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)調控，具有促進突觸間小分子如環磷酸腺苷、三磷酸肌醇和 Ca2+的跨膜轉運的功能[3]。研究顯示，Cx36敲除會導致海馬和皮質中神經元縫隙連接丟失，影響神經元振蕩活動[4]。此外，在認知功能障礙的老齡大鼠海馬中可見明顯的Cx36表達減少[5]。因此，本研究擬采用出生后7日齡幼鼠，吸入七氟醚麻醉后檢測Cx36的表達。通過益母草堿給藥，探究其對七氟醚誘導幼鼠認知功能的改善作用與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的SPF級SD大鼠母鼠及其所產乳鼠，乳鼠約7 d齡，體重10～15 g，60只，由海南藥物研究所有限責任公司提供。飼養條件：溫度(25±2)℃，濕度(55±5)%，晝夜循環12/12 h，訂制孕鼠飼料，自由飲水，母鼠與其乳鼠同窩喂養。

1.2 實驗分組與方案 乳鼠在7日齡時以3%七氟醚麻醉，持續6 h。將麻醉后乳鼠隨機分為七氟醚組、益母草堿-低劑量組(益母草堿-L,2.5 mg/kg)、益母草堿-中劑量組(益母草堿-M,5 mg/kg)、益母草堿-高劑量組(益母草堿-H,10 mg/kg)，對照組乳鼠僅吸入載體空氣，持續3 h，每組12只。乳鼠麻醉后每日腹腔注射對應劑量的益母草堿，連續給藥28 d，對照組與七氟醚組分別給予等體積0.9%氯化鈉溶液。幼鼠約35 d時，開展水迷宮測試，期間持續給藥。水迷宮完成后取腦組織分別開展電生理測試評估長時程增強，采用HE染色評估神經元狀態，通過高爾基染色檢測神經元樹突棘狀態，利用Western blot檢測CaMKⅡ/Cx36信號通路蛋白表達。

1.3 實驗試劑與儀器 益母草堿(美國MCE公司，規格：25 mg，純度≥ 99.0%)；七氟醚(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：H20190206)；人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF，南京億迅生物科技有限公司)；高爾基染色試劑盒(美國Hitobiotec公司)；Anti-Cx36、Anti-p-CaMKⅡ、Anti-CaMKⅡ、β-actin抗體(美國Abcam公司)；HRP標記山羊抗鼠/兔抗體(上海碧云天生物科技公司)；Morris水迷宮設備與系統(江蘇賽昂斯生物科技有限公司，型號：SA201)；膜片鉗放大器系統(瑞士Axon公司，型號：MultiClamp 700B，MultiClamp 1550B)；激光共聚焦顯微鏡(美國Thermo公司，型號：CellInsight CX7 LZR)；電泳儀(美國Bio-rad公司，型號：Mini-PROTEAN Tetra)；顯影儀(上海天能科技有限公司，型號：1600/1600R)。

1.4 水迷宮測試 水迷宮裝置是一個直徑1.2 m，深0.5 m的圓形水池，分為4個象限，第Ⅰ象限設置一個半徑6 cm的圓形平臺。正上方固定一個攝像機，記錄幼鼠的游泳線路。訓練期間，將幼鼠投入水中，自由游泳90 s，當幼鼠登上逃生平臺，記錄這段時間為逃避潛伏期；若幼鼠未找到平臺，則引導至平臺。訓練4 d，撤去平臺，將幼鼠投入第Ⅲ象限中，記錄90 s內幼鼠游泳軌跡，軟件分析獲得幼鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數、第Ⅰ象限停留時間。

1.5 電生理測試 將幼鼠處死，以預冷氧飽和高糖緩沖液經體外循環灌注，取出腦組織，包埋后制備橫向腦組織切片，厚度約400 μm。將切片轉移至32℃的氧飽和ACSF中平衡以維持神經元狀態。定位腦組織海馬 CA1 區，插入聚四氟乙烯涂層的鎢絲電極(A-M Systems)，刺激 Schaffer collateral-commissural通路引發場興奮性突觸后電位 (field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)，以充滿 ACSF 的玻璃微電極記錄信號。在此期間，調整刺激強度以引發不同的fEPSP，設基線為200 μA電流下誘導的最大值的40%。固定電極與刺激強度，穩定記錄20 min，更換高頻刺激誘發長時程電位增強(long term potentiation,LTP)，連續20串刺激，每串包含200個脈沖，頻率為200 Hz，波寬200 μs，串間隔30 s，記錄60 min。

1.6 高爾基染色 根據試劑盒說明書開展高爾基染色。將幼鼠處死，以預冷的PBS經體外循環灌注。取腦組織浸泡于試劑盒中的溶液1、2混合液(溶液1、2及以下的溶液3、4、5均來自于試劑盒)中，4℃避光儲存14 d。取出腦組織浸入5倍體積的溶液3中，4℃避光孵育48 h。取出腦組織放入預冷的異戊烷中冷凍并切成約10 μm的切片，轉移至滴有溶液3的載玻片上貼片。將切片放入溶液4、5混合液中反應30 min，以蒸餾水沖洗玻片。再通過梯度乙醇脫水，以二甲苯Ⅰ與二甲苯Ⅱ透化，使用中性樹膠封片。顯微鏡下捕獲突觸圖像，對樹突棘密度和長度統計。

1.7 Western blot 幼鼠處死后取海馬組織，加入RIPA裂解液研磨成單細胞懸液，離心后上樣緩沖液。開展SDS-PAGE凝膠電泳，電壓條件：60 V，30 min;120 V，60 min。截取目標蛋白條帶，通過濕法轉膜將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件：2 Ma,60 min。取出PVDF膜，4%脫脂牛奶，以一抗稀釋液孵育，4℃過夜，包括Anti-Cx36、Anti-p-CaMKⅡ、Anti-CaMKⅡ(1∶1 000)。次日，取出PVDF膜，滴加HRP標記IgG(H+L)二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫避光孵育2 h。將ECL發光液滴加的PVDF膜上，顯影獲得蛋白條帶。

2 結果

2.1 Morris水迷宮試驗評估幼鼠認知功能結果 訓練期間，自第2天開始，與對照組相比，七氟醚組幼鼠水迷宮訓練期間逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)；自第3天起，與七氟醚組相比，益母草堿-H組幼鼠逃避潛伏期明顯減少(P<0.05)；與此同時，與益母草堿-L組相比，益母草堿-H組逃避潛伏期也明顯減少(P<0.05)。測試期間，與對照組相比，七氟醚組逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)，第Ⅰ象限停留時間和穿越平臺次數明顯減少(P<0.05)；與七氟醚組相比，益母草堿-H組逃避潛伏期明顯減少(P<0.05)，第Ⅰ象限停留時間與穿越平臺次數明顯增加(P<0.05)。見表1、2。

表1 水迷宮訓練期間幼鼠逃避潛伏期比較

表2 水迷宮測試期間幼鼠各項指標比較

2.2 電生理檢測長時程電位增強結果 與對照組相比，七氟醚組幼鼠長時程增強電位水平明顯降低(P<0.05)，與七氟醚組相比，益母草堿-M/H組長時程電位水平明顯增加(P<0.05)，且與益母草堿-L組相比，益母草堿-H組長時程電位水平明顯增加(P<0.05)。見圖1。

圖1 5組幼鼠長時程增強電位的變化；a表示與對照組相比P<0.05；b表示與七氟醚組相比P<0.05；c表示與益母草堿-L組相比P<0.05；F=3.76，P=0.005

2.3 高爾基染色評估神經元樹突棘狀態結果 對照組幼鼠海馬神經元樹突棘形態比較規則、排列整齊、密度大、蘑菇狀樹突棘數目較多；與對照組相比，七氟醚組樹突棘分支數量明顯減少、形態不規則、排列松散、長度縮短；在益母草堿治療的3組中，與七氟醚組相比，益母草堿-L組樹突棘形態、總量和蘑菇狀樹突棘變化均不顯著(P>0.05)；而益母草-H組樹突棘密度與長度明顯增加(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 5組幼鼠神經元樹突棘高爾基染色

表3 5組幼鼠神經元樹突棘密度與長度比較

2.4 Western blotting 檢測CaMKⅡ與Cx36蛋白表達結果 與對照組相比，七氟醚組幼鼠海馬組織中p-CaMKⅡ與Cx36表達明顯減少(P<0.05)；與七氟醚組相比，益母草堿-M/H組p-CaMKⅡ與Cx36表達明顯增加(P<0.05)；此外，與益母草堿-L組相比，益母草堿-H組p-CaMKⅡ與Cx36表達明顯增加(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 5組幼鼠CaMKⅡ與Cx36蛋白電泳圖

表4 5組幼鼠CaMKⅡ與Cx36蛋白表達量化統計比較

3 討論

隨著社會進步，越來越多患有先天性疾病的嬰幼兒可通過手術矯正。七氟醚相比于其他麻醉藥物，具有效能高、易控制、恢復快、刺激小的優勢，在嬰幼兒手術中廣泛應用[6]。然而，七氟醚麻醉期間腦組織中葡萄糖代謝會不同程度降低[7]。相比腦組織成熟發育的成年人，嬰幼兒患者更易受到葡萄糖代謝紊亂的影響，在全麻手術后近期或遠期出現不同程度的認知功能損傷。

認知功能障礙是幼兒手術后常見的一種中樞神經并發癥，主要表現為記憶力、抽象思維及定向力障礙。文獻中顯示，七氟醚麻醉會對剛出生幼鼠少突膠質細胞成熟和髓鞘的形成產生不可逆的影響，成年后表現出減少的探索行為與增加的焦慮樣癥狀[8]。為了模擬臨床，本研究通過3%七氟醚麻醉7 d齡幼鼠6 h。結果顯示，Morris水迷宮訓練與測試期間七氟醚組幼鼠逃避潛伏期明顯增加，穿越平臺次數與第Ⅰ象限停留時間減少。Morris水迷宮是一種評估嚙齒類動物行為記憶、空間探索功能的研究方法。訓練期間逃避潛伏期的減少與動物學習能力相關，而測試期間空間探索中穿越平臺次數及第Ⅰ象限停留時間反映了動物記憶能力[9]。因此，以上結果提示本研究POCD模型構建成功。此外，益母草堿-M/H組幼鼠逃避潛伏期明顯低于七氟醚組，且穿越平臺次數與第Ⅰ象限停留時間明顯增加，但益母草堿-L組各項指標沒有明顯改變，說明益母草堿治療可以改善七氟醚麻醉幼鼠的認知功能，且存在劑量依賴性。

突觸是指神經元之間或與其他細胞之間相互連接的接觸點。樹突棘是建立突觸聯系的基本結構，Cx36是突觸縫隙連接的主要底物，兩者共同構成突觸結構，誘導興奮性信號傳導[10]。POCD模型大鼠腦中常見明顯的樹突棘萎縮，蘑菇狀結構消失，樹突棘密度降低的病理特征[11]。本研究結果與文獻中POCD模型動物病理癥狀一致，5組七氟醚誘導幼鼠海馬組織中樹突棘萎縮，密度降低。此外，七氟醚誘導幼鼠海馬組織中Cx36表達與p-CaMKⅡ表達明顯減少。Cx36作為突觸間縫隙連接底物，影響著突觸間神經遞質的傳遞效率。在MPTP點燃的癲癇小鼠模型中，通?？梢娒黠@的Cx36表達增加，造成突觸傳遞過度興奮，產生連續的去極化與超極化，導致異常放電[12]。CaMK Ⅱ屬于絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶家族，受Ca2+調控，通過磷酸化與Cx36結合，在神經元與其他蛋白之間形成“電突觸”，促進興奮性信號的傳導[13]。已有研究表明CaMK Ⅱ在海馬區密集分布，抑制CaMK Ⅱ信號會影響小鼠海馬區突觸可塑性，繼而影響小鼠的空間學習及記憶能力[14]。

突觸可塑性是基于樹突棘結構與縫隙連接蛋白改變產生的傳遞效能變化[15]。LTP是突觸可塑性的量化表現，是在短暫快速重復性刺激下，突觸間電位持續性增強的現象，反映了動物的學習和記憶功能[16]。由于大腦邊緣系統海馬組織對葡萄糖代謝障礙最為敏感，是POCD患者受損最早且最易受累的腦區，其LTP損害與學習記憶的缺損高度相關[17]。因此海馬區LTP誘導操作容易，已成為LTP研究的典型區域。本研究顯示，七氟醚刺激下，LTP水平降低，提示七氟醚造成海馬突觸可塑性損傷。此外，與七氟醚組相比，益母草堿-H組樹突棘狀態明顯改善，LTP水平明顯增加，且海馬組織中p-CaMKⅡ與Cx36表達明顯增加。因此，益母草堿對樹突棘和縫隙連接構成的突觸可塑性具有明顯的調節作用。

綜上所述，益母草堿可以逆轉七氟醚造成的樹突棘密度與長度的減少，增加LTP水平，提高幼鼠海馬組織神經元突觸可塑性，改善幼鼠的學習、記憶功能，且該保護作用可能涉及CaMKⅡ/Cx36信號的激活。然而，本研究也存在一定的局限性，本研究僅檢測了p-CaMKⅡ與Cx36表達，卻沒有通過抑制劑或激動劑探究CaMKⅡ/Cx36信號對海馬神經元突觸可塑性的影響。此外，幼鼠全麻后出現認知功能損傷往往與神經元新生抑制相關[18]，進一步研究中應繼續探討CaMKⅡ/Cx36信號對神經元新生的影響。