硒對子癇前期合并膽汁淤積患者內皮祖細胞的作用

王新玲 侯慧卿 肖玲 張紫鈺 李麗

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)存在于機體外周血、臍血、骨髓中，在修復受損血管、促進血管新生及生長中發(fā)揮直接的關鍵作用[1]；而微量元素作為機體維持正常生理功能不可或缺的元素，亦充當部分酶、激素的重要組成部分而直接參與機體細胞代謝，調節(jié)物質代謝；也被稱之為機體內的抗氧化劑。硒作為一種必需微量元素，是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活化中心的一部分，可提高GSH-Px的活性，提升谷胱甘肽(GSH)的水平，抑制活性氧的產生，進而減輕血管內皮損傷[2]。本研究對硒對在癇前期合并膽汁淤積患者內皮祖細胞的作用進行研究，為臨床進一步的診療、疾病預防和檢測提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年6月至2022年4月在我院住院的子癇前期合并膽汁淤積的患者34例，年齡25～37歲，平均年齡(30.12±4.37)歲；孕次1～2歲，平均(1.41±0.62)次；產次0～2歲，平均(1.33±0.57)次；身高152～167 cm，平均(157.69±5.32)cm；體重55～73 kg，平均(158.32±10.19)kg。采集其晨間空腹靜脈血60 ml，加入肝素抗凝。

1.2 納入與排除標準

1.2．1 納入標準：①患者均符合中華醫(yī)學會婦產科學分會產科學組和妊娠期高血壓疾病學組發(fā)布的“妊娠期肝內膽汁淤積癥診療指南(2015)”[3]， “妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)”相關診斷標準[4]；②患者出現皮膚瘙癢或其他提示有膽汁淤積癥的癥狀，且經實驗室檢查確診；③患者和(或)家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①病歷資料不完整，未在我院進行系統產檢者；②原發(fā)性高血壓、糖尿病患者；③肝腎功能異常者；④合并其他影響本實驗結果的疾病者；⑤有精神障礙不能配合本研究者。

1.3 主要試劑及材料 肝素結合蛋白(中翰盛泰生物有限公司)；人纖維連接蛋白(Fn，Gibco公司)；全培養(yǎng)液RPMI1640(lonza公司)；淋巴細胞分離液Histopaque 1077、FITC-UEA-I均來自Sigma公司；Dil-AcLDL(Molecular probes公司)；胎牛血清Fetal Bovine Serun(FBS，Gibco公司)；流式細胞儀(Beck Man Coulter)；MTT試劑盒(Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSo，江蘇Beyotime碧云天生物技術研究所)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒；預染蛋白質分子標準(Fermentas公司)；PE標記的VEGFR-2、CD133單克隆抗體均來自abcam公司；PE直標CD34單克隆抗體來自艾美捷科技；化學發(fā)光成像儀器ChemiDoc XRS(Bio-Rad，Canada)；Corning Transwell小室Transwell板(24孔，0.4 μm；濾膜直徑：6.5 mm；濾膜孔徑0.4 μm)為costar品牌，來自北京萌壯科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 內皮祖細胞分離、培養(yǎng)、鑒定：①置于5%CO2飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)﹥2 h；②應用PBS按比例稀釋靜脈血，再加入淋巴細胞分離液進行密度梯度離心處理后吸取白膜層(中間厚1～2 mm)，并收集單個核細胞(MNCs)；③將收集到的單個核細胞用l-dmem培養(yǎng)基離心洗滌1～2次，收集細胞，用egm-2培養(yǎng)基重懸細胞并計數；所述egm-2培養(yǎng)基含有體積百分比為10%的胎牛血清、100 U/ml雙抗以及血管內皮生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素樣生長因子-1；分別將單個核細胞種植于用50 μg/ml濃度的鼠尾膠原蛋白預先包被過的6孔細胞培養(yǎng)板中，置39℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)；每24小時半量換液1次；5 d后每24小時換液1次，7 d后每48小時換液一次直到傳代。④待細胞貼壁完全后用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定。細胞在培養(yǎng)液中避光孵育，然后以固定，液漂洗后再避光孵育。PBS液漂洗后在熒光顯微鏡下觀察，紅色為ac-LDL陽性細胞，綠色為UEA-1陽性細胞，顯示雙熒光陽性(黃色)的細胞被認為是EPC，隨機計數10個非重疊視野，計算雙陽性細胞比例。

1.4.2 實驗分組設計：①將微量元素與PBS配置成濃度為4、8、16 mmol/L的3組；②實驗分為對照組(常規(guī)RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng))、4 mmol/L、8 mmol/L、16 mmol/L微量元素組，將對應計量的微量元素加入RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，再移除含微量元素的RPMI 1640培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)24 h后觀察細胞形態(tài)。

1.4.3 MTT比色法檢測微量元素硒對內皮祖細胞增殖的影響：將5×103個內皮祖細胞與100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液充分混勻后接種于96孔細胞培養(yǎng)板(每組6個復孔及空白對照組)，待細胞貼壁生長后，將實驗組更換RPMI 1640培養(yǎng)液，劑量100 μl，分別加入含不同劑量的微量元素硒的100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h后加入含20 μl MTT(5 g/L)4 h后棄上清，再加入100 μl二甲基亞砜充分振蕩溶解結晶物，37℃恒溫孵育3 h后顯微鏡下觀察，以對照組凋零，測定各孔在波長450 mm下的吸光度值，采用酶標儀(波長490 nm)測定各孔吸光度(A)值。

1.4.4 Corning Transwell小室檢測微量元素硒對內皮祖細胞黏附及遷移功能的影響：將600 μl 內皮祖細胞培養(yǎng)基加入下室培養(yǎng)24 h，加入濃度為140 μmol/L的3% H2O2或終濃度為4 ml的微量元素，對照孔不作處理，經過培養(yǎng)-洗滌-固定-結晶紫染色-洗滌-晾干-封片，按9個視野/膜在高倍光學顯微鏡下觀察，并計數細胞，重復實驗3次，取3次平均值作為最終細胞計數。

1.4.5 微量元素對caspase-3 mRNA、caspase-3蛋白的影響：①RT-PCR法檢測微量元素對caspase-3 mRNA的影響：將孵育結束后的細胞經過洗滌-吹打裂解-振蕩-離心-冰浴-離心-沉淀-離心-沉淀棄上清-晾干-吹打沉淀，充分溶解RNA，檢測RNA濃度，參照RT-PCR試劑盒(Promegag公司)說明書去進行檢測，Caspase-3/GAPDH比值即為Caspase-3 mRNA表達水平；②Western blot法檢測Caspase-3蛋白表達量：取處理好的內皮祖細胞，經洗滌-消化細胞-離心-裂解-離心-保存，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白質濃度，再經過電泳-轉膜-洗滌，采用化學發(fā)光法(試劑盒Promegag公司)檢測抗體反應及顯色。

2 結果

2.1 微量元素硒對內皮祖細胞增殖的影響 與對照組比較，隨著微量元素硒濃度增加，A值逐漸上升，且16 mmol/L微量元素組﹥8 mmol/L微量元素組﹥4 mmol/L微量元素組﹥對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 H2O2、微量元素硒對內皮祖細胞增殖的影響

2.2 微量元素硒對內皮祖細胞遷移活性的影響的影響 高倍鏡視野下，16 mmol/L微量元素組遷移細胞數﹥8 mmol/L微量元素﹥4 mmol/L微量元素﹥對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示隨著微量元素硒濃度的增加，內皮祖細胞遷移能力增強。見表2。

表2 微量元素硒對內皮祖細胞遷移能力的影響

2.3 RT-PCR法檢測微量元素硒對caspase-3 mRNA的影響 對照組比較，不同濃度條件下，caspase-3 mRNA表達均顯著下降，且隨濃度增加，caspase-3 mRNA表達逐漸降低，16 mmol/L微量元素組Caspase-3 mRNA﹤8 mmol/L微量元素組﹤4 mmol/L微量元素組﹤對照組，差異有統計意義(P<0.05)。見表3。

表3 RT-PCR法檢測微量元素硒對caspase-3 RNA的影響

2.4 硒對caspase-3蛋白的影響 與對照組比較，不同劑量的硒均使caspase-3 蛋白表達量顯著下降，且隨劑量增加，caspase-3 蛋白表達量逐漸降低。16 mmol/L微量元素組Caspase-3 蛋白表達量﹤8 mmol/L微量元素﹤2 mmol/L微量元素﹤對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 微量元素對caspase-3蛋白的影響

3 討論

3.1 子癇前期與妊娠期肝內膽汁淤積癥 子癇前期和妊娠期肝內膽汁淤積癥是在妊娠中、晚期兩種常見的并發(fā)癥[5，6]。說明妊娠期膽汁淤積癥與先兆子癇風險增加有關，建議加強對妊娠期膽汁淤積癥女性先兆子癇的隨訪，尤其是那些早期妊娠期膽汁淤積癥表現和雙胞胎妊娠的女性[7]。子癇前期患者易發(fā)生早產、羊水過多、產后出血及胎死宮內等不良結局[8，9]。子癇前期患者大多會合并糖脂代謝異常，可誘導大量的活性氧(ROS)產生，加劇氧化應激反應，造成血管內皮功能障礙。妊娠期膽汁淤積癥患者累積的膽汁酸也可導致氧化應激，使血管內皮生長因子水平失衡，血管內皮受損[10]。有研究表明,子癇前期患者和妊娠期膽汁淤積癥患者外周血中的內皮祖細胞數量和血管內皮生長因子水平均下降[11,12]。因此，減緩氧化應激反應，改善血管內皮細胞功能，值得探究。

3.2 內皮祖細胞與子癇前期的關系 血管重構是妊娠的重要組成部分。研究發(fā)現，當血管內皮損傷時，骨髓中的內皮祖細胞可遷移、黏附至缺血部位，分泌血管生長因子并分化成血管內皮細胞，促進血管新生及血管修復[13]。內皮祖細胞在血管穩(wěn)態(tài)的調節(jié)中起重要作用，因此測量正常妊娠和先兆子癇中內皮祖細胞數量十分重要。一般來說，在正常妊娠中，隨著胎齡的增加，母體循環(huán)中內皮祖細胞的數量會增加。在發(fā)生先兆子癇的情況下，臍帶血中內皮祖細胞的數量會減少。Xia等[14]研究發(fā)現，與對照組相比，先兆子癇組的胎盤/胎兒循環(huán)EPC數量顯著降低(P< 0.001)，在體外培養(yǎng)后，先兆子癇組的EPC數量也有所減少(P< 0.001)，循環(huán)EPC和培養(yǎng)的 EPC 都與可溶性 fms 樣酪氨酸激酶 1 (sFlt-1) 的臍帶血水平呈負相關，且先兆子癇患者的 EPC 的增殖、遷移和血管生成能力明顯受損。其原因是在氧化應激反應中，GSH-Px等對ROS具有清除能力的酶活性降低，使ROS積聚，導致內皮祖細胞的數量減少，功能受損[15]。

3.3 硒的作用 硒的生物學功能由硒蛋白執(zhí)行，以催化和抗氧化活性而著稱。硒作為必需微量元素之一，是GSH-Px的重要活性組分。據報道，硒可調控ROS的含量，清除體內自由基，發(fā)揮抗氧化作用，維持機體氧化還原的平衡[16]。在脊椎動物和無脊椎動物中，硒是一種必需的微量營養(yǎng)素，硒缺乏或過量與雄性和雌性的性腺功能不全和配子功能障礙有關，導致著床失敗、胚胎發(fā)育改變并最終導致不育。Silva等[17]系統評價的證據表明，較低的硒水平可增加妊娠期高血壓的發(fā)生風險。Xu等[18]報道硒與子癇前期之間呈負相關。與血壓正常的孕婦相比，子癇前期患者血液中的硒水平較低。早前的臨床觀察類實驗也提示孕婦體內硒的含量與子癇前期的發(fā)生風險密切相關[19，20]。Dahabiyeh等[21]發(fā)現子癇前期婦女血漿中氧化AGT的比例高于匹配的血壓正常的孕婦對照組(P=0.006)，在子癇前期組，血壓與氧化AGT比例相關;血漿GSH-Px與氧化AGT呈負相關，血清硒濃度與氧化AGT比例呈負相關。Shoeibi[22]的研究表明，硒具有抗氧化和抗炎活性，可有效預防氧化損傷和改善生理過程，可被視為可以改善血管問題的有效藥物。本研究發(fā)現，硒可促進子癇前期合并膽汁淤積患者外周內皮祖細胞的增殖并提高其遷移活性。提示硒提高了細胞的抗氧化能力，減緩了氧化應激反應。鑒于此，推薦妊娠期以65 μg/d為標準補充硒元素，以提高內皮祖細胞的活性，預防子癇前期、妊娠期膽汁淤積癥的發(fā)生和發(fā)展。

3.4 硒與Caspase的關系 氧化應激還可導致線粒體功能障礙，啟動細胞凋亡的線粒體途徑，引發(fā)Caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡[23]。Caspase-3作為細胞凋亡的執(zhí)行者，當其被激活，標志著細胞進入凋亡階段，可導致蛋白質降解，引發(fā)細胞死亡。基礎研究顯示，硒缺乏可通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，上調caspase-3mRNA的表達[24]。Zhu等[25]通過無定形硒納米粒子(A-SeQDs)對異卡磷誘導的血管功能障礙本研究，發(fā)現A-SeQDs可以減少大鼠體內的總二氧化碳、MDA、VCAM-1、ICAM-1、IL-1 和 IL-6，同時增加氧飽和度、NO含量和SOD活性。A-SeQDs 還導致大鼠血管形態(tài)相對正常，鈉氫交換器 1 (NHE1)和caspase-3 的表達降低。此外，在用異卡磷處理的人臍靜脈內皮細胞HUVEC中，A-SeQD 可以維持線粒體膜電位，抑制裂解的caspase-3 表達，并將細胞色素c從線粒體釋放到細胞質中，說明A-SeQDs可通過線粒體途徑抑制人臍靜脈內皮細胞的凋亡，有效治療NHE1依賴性異卡磷引起的血管內皮功能損傷。本結果顯示，與對照組相比，不同劑量的硒均使caspase-3 蛋白表達量顯著下降，蛋白表達量16 mmol/L微量元素組Caspase-3 ﹤8 mmol/L微量元素﹤4 mmol/L微量元素﹤對照組(P<0.05)。提示補充硒元素可通過其抗氧化作用，減少氧化應激損傷，促進血管內皮的恢復，對內皮祖細胞凋亡具有保護作用。

綜上所述，硒對子癇前期合并膽汁淤積患者的內皮祖細胞增殖及遷移活性、Caspase-3表達有重要影響。重視對微量元素的監(jiān)測，并指導孕婦注重營養(yǎng)均衡，按需補充，有利于防治妊娠并發(fā)癥和促進母嬰健康。