基于數據庫篩選補中益氣湯中7種黃酮類成分及其含量分析

曹禮慧 徐漢明 袁中文 陳朋 馮森玲

摘要：目的 篩選補中益氣湯治療子宮脫垂7種黃酮類成分及其含量分析。方法 運用TCMSP數據庫篩選補中益氣湯治療子宮脫垂的關鍵化合物，采用HPLC法分析關鍵化合物的含量，Agilent SB-C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），流動相為色譜乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫，進樣量10μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫為30℃。結果 通過數據庫篩選出7種黃酮類成分，包括槲皮素、山柰酚、柚皮素、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮。結論 建立HPLC法測定補中益氣湯治療子宮脫垂的7種黃酮類成分，該含量測定方法穩定、可靠、準確，可用于補中益氣湯質量控制并指導臨床用藥。

關鍵詞：補中益氣湯;TCMSP數據庫;高效液相色譜法;黃酮類成分;含量分析

中圖分類號：R285.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）02-0071-04

Content Analysis of Seven Flavonoids Compounds in Buzhong YiqiDecoction Based on Database

CAO Li-hui1， XU Han-ming2， YUAN Zhong-wen1， CHEN Peng3， FENG Sen-ling1

（1.The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University/Guangdong Provincial Key Laboratoryof Obstetrics Major Diseases， Guangzhou 510150， China;2. Shenzhen Hospital of Beijing University， Shenzhen 518033， China; 3. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China）

【Abstract】Objective： To analyze the content of seven flavonoids compounds in Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse patients. Methods： The key compounds of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse were screened by using TCMSP database， and the content of key compounds was analyzed by HPLC. Agilent SB-C18 column was 250mm×4.6mm， 5μm， and the mobile phase was acetonitrile-0.05% phosphoric acid aqueous solution gradient elution. The injection volume was 10 μL and the flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 254 nm， and the column temperature was 30 ℃. Results： Seven flavonoids were screened from the database， including quercetin， kaempferol， naringenin， isorhamnetin， formononetin， nobiletin and calycosin. Conclusion： A HPLC method was established for the determination of seven flavonoids in Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse. The content determination method is stable， reliable and accurate， and can be used for quality control of Buzhong Yiqi Decoction and guide clinical medication.

【Key words】Buzhong Yiqi Decoction; TCMSP Database; High Performance Liquid Chromatography; Flavonoids; Content Analysis

補中益氣湯[1]來源于名醫李東恒《脾胃論》，主治脾胃氣虛證、氣虛下陷證和氣虛發熱證。子宮脫垂[2]是盆腔臟器脫垂的主要表現形式，其嚴重影響了患者的正常生活，目前發病機制仍不清楚，只能通過對癥治療減輕患者的不適，無法徹底根治[3-4]。文獻研究表明[5-6]，補中益氣湯可能是通過提高TGFβ-3表達或通過抑制miR-30d表達，增加盆腔臟器脫垂大鼠子宮骶韌帶膠原蛋白的合成，從而改善盆腔臟器脫垂情況。也有文獻通過臨床研究發現[7-9]，試驗組服用補中益氣湯后子宮脫垂的臨床癥狀較對照組明顯改善。補中益氣湯作為復方，具有化學成分復雜，使得治療子宮脫垂的藥代動力學研究中的目標化合物不明確[10]。研究通過TCMSP數據庫篩選補中益氣湯治療子宮脫垂的關鍵化合物，繼而建立高效液相色譜法分析含量，此方法的建立為補中益氣湯治療子宮脫垂關鍵化合物的質量控制提供有效依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司;FR224CN型電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司;KQ-300E型超聲機，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 樣品與試劑 槲皮素（批號：100081-200406，中國生物制品檢定所）、山柰酚（批號：S-014-121218，天津市科曼思特醫藥科技發展有限公司）、柚皮素（批號：L09834，大連美侖生物技術有限公司）、異鼠李素（批號：110860-201611，中國食品藥品檢定研究院）、刺芒柄花素（批號：N0301AS，大連美侖生物技術有限公司）、川陳皮素（批號：B20199，上海源葉生物科技有限公司）、毛蕊異黃酮（批號：D0806AS，大連美侖生物技術有限公司）;色譜級乙腈（Sigma 公司），超純水（自制），其余試劑均為分析純。

補中益氣配方顆粒（批號：黃芪20032711、人參20009131、白術20020101、炙甘草20031601、當歸20028041、陳皮20017121、升麻20039941、北柴胡20033021，北京康仁堂藥業有限公司）。

2 方法與結果

2.1 關鍵化合物的篩選 利用TCMSP數據庫，以“黃芪”、“人參”、“甘草”、“白術”、“升麻”、“柴胡”、“陳皮”、“當歸”為關鍵詞，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，對化合物進行篩選，根據UniProt數據庫對靶點進行標準化處理，將靶點轉化為對應基因，限定物種為“Homo Sapiens”獲得補中益氣湯活性成分及對應靶點，剔除重復及與UniProt匹配后補中益氣湯共117個靶點;通過GeneCards數據庫，以“uterine prolapse”作為關鍵詞檢索，獲取子宮脫垂靶點667個，其中與補中益氣湯的交集靶點共37個。使用Cytoscape軟件構建“中藥-化合物-交集靶點”網絡，其中度值較高的化合物有槲皮素、山柰酚、柚皮素、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮等，可能是補中益氣湯治療子宮脫垂的關鍵化合物，見表1。

2.2 含量分析方法與結果

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），柱溫為30℃，進樣量10μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長：254 nm下測定，流動相為色譜乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫條件：0～10 min，10%乙腈;10～30 min，10%～80%乙腈;30～31 min，80%～10%乙腈;31～45 min，10%乙腈。見表2。

2.2.2 對照品溶液的制備 取柚皮素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度約為0.5mg/mL溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取補中益氣配方顆粒（黃芪6 g，人參1.8 g，白術1.8 g，炙甘草3 g，當歸1.2 g，陳皮0.6 g，升麻0.6 g，柴胡0.6 g，合計15.6 g），研細，取0.5 g。精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，超聲處理（功率300w，頻率40kHZ）50min，放冷，用70%乙醇定容至50 mL，搖勻，靜置，取上清液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系考察 按照“2.2.1”項下色譜條件，分別向HPLC中注入混合對照品溶液5、10、15、20、25μL，在254 nm處測定峰面積值，并以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得7種黃酮類化合物的線性回歸方程分別為：Y=612.334X+0.0574，R2=0.9926，表明柚皮素在0.0015-1.1452 mg/mL與峰面積呈良好線性關系;Y=583.690X+0.0641，R2=0.9938，表明槲皮素在0.0014-1.2471 mg/mL與峰面積呈良好線性關系;Y=468.614X+0.0741，R2=0.9974，表明山柰酚在0.0031-1.1479 mg/mL與峰面積呈良好線性關系;Y=502.387X+0.0063，R2=0.9945，表明異鼠李素在0.0027-1.2478 mg/mL與峰面積呈良好線性關系;Y=452.842X+0.0149，R2=0.9916，表明川陳皮素在0.0019-1.2407 mg/mL與峰面積呈良好線性關系;Y=597.675X+0.0473，R2=0.9938，表明毛蕊異黃酮在0.0018-1.1389 mg/mL與峰面積呈良好線性關系;Y=653.714X+0.0673，R2=0.9942，表明刺芒柄花素在0.0021-1.2370 mg/mL與峰面積呈良好線性關系。見表3。

2.2.4.2 重復性試驗 取同一批次的補中益氣配方顆粒樣品，按“2.2.3”項下方法平行處理，制備供試品溶液6份，按上述“2.2.1”項下色譜條件吸取供試品溶液各10 μL，注入HPLC進行分析。柚皮素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮質量分數的RSD分別為1.37%、1.14%、1.71%、1.54%、1.19%、1.27%和0.96%，各個黃酮類化合物的RSD值均小于2%，表明本方法重復性良好。

2.2.4.3 加樣回收率試驗 取同一批次的補中益氣配方顆粒樣品，按“2.2.3”項下方法平行處理，制備供試品溶液6份，置于具塞三角燒瓶內，分別加入柚皮素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮對照品適量，按上述“2.2.1”項方法處理，測定各個黃酮類化合物的含量。測得柚皮素的平均回收率為99.388%，RSD=1.25%;測得槲皮素的平均回收率為99.209%，RSD=1.49%;測得山柰酚的平均回收率為100.84%，RSD=1.42%;測得異鼠李素的平均回收率為99.138%，RSD=1.38%;測得川陳皮素的平均回收率為100.526%，RSD=0.61%;測得毛蕊異黃酮的平均回收率為101.557%，RSD=1.80%;測得刺芒柄花素的平均回收率為100.500%，RSD=0.73%。見表4。

2.2.5 樣品含量測定 將“2.2.3”項目下的供試品溶液按照“2.2.1”的條件進行測定。根據樣品中各個黃酮類化合物的出峰面積帶入標準曲線中，計算得到樣品中柚皮素的含量為5.613 mg/mL;測得槲皮素的含量為1.147 mg/mL;測得山柰酚的含量為0.482 mg/mL;測得異鼠李素的含量為0.239 mg/mL;測得川陳皮素的含量為0.550 mg/mL;測得毛蕊異黃酮的含量為0.947 mg/mL;測得刺芒柄花素的含量為1.371 mg/mL。如圖1。

3 討論

通過TCMSP數據庫篩選中益氣湯治療子宮脫垂的關鍵化合物。得到37個交集靶點，利用Cytoscape軟件構建“中藥-化合物-交集靶點”網絡，其中度值排名靠前的化合物，分別有槲皮素、山柰酚、柚皮素、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮，推測可能為補中益氣湯治療子宮脫垂的關鍵化合物。研究發現[11]，槲皮素、山柰酚、異鼠李素等均具有抗炎作用，補中益氣湯可能通過降低氧化應激通路、減輕炎癥反應等達到治療子宮脫垂。

采用高效液相色譜法進一步對補中益氣湯治療子宮脫垂的7種黃酮類成分進行含量分析，為補中益氣湯的質量控制提供數據支撐。通過二極管陣列檢測器全波長掃描，所測的7種黃酮類成分在254 nm處測得各個黃酮化合物的色譜峰均有良好響應，并且在此波長下，其他類型的化合物對黃酮色譜峰峰面積影響較小，所以本實驗選取254 nm作為檢測波長。考察不同流動相組合，包括水-甲醇、水-乙腈、磷酸水-甲醇和磷酸水-乙腈，發現0.05%磷酸水-乙腈做為流動相，7種黃酮類化合物的色譜分離效果最好，峰形對稱。選取等度洗脫系統時，各個色譜峰不能完全分離，故本實驗采取梯度洗脫系統，并根據各個色譜峰出峰位置進一步調整，優化得到2.2.1項下色譜條件。

中藥含有的藥效成分復雜多樣，明確其中關鍵藥效物質對中藥的質量控制起到至關重要的作用。通過TCMSP數據庫選篩選補中益氣湯中治療子宮脫垂可能的關鍵化合物，然后建立高效液相色譜測定篩選出的7種黃酮類成分在補中益氣湯中的含量方法，經過線性關系考察、重復性實驗檢測和標準加入實驗驗證，該含量測定方法靈敏度高，線性關系良好，可重復性高，表明該方法穩定、可靠、準確，為補中益氣湯的質量控制綜合評價提供了更加全面的參考。

參考文獻：

[1]北京中醫藥學會脾胃病專業委員會.參苓白術散和補中益氣方臨床應用專家共識意見[J].北京中醫藥，2018，37（7）：590-597.

[2]劉丹，夏志軍.美國婦產科醫師學會“盆腔器官脫垂臨床實踐指南（2017版）”解讀[J].中國實用婦科與產科雜志，2018，34（10）：1111-1114.

[3]Wilson L，Brown J S，Shin G，P，et al.Annual direct cost of urinary incontinence[J].Obstetrics and Gynecology，2001，98（3）：398-406.

[4]Pena O J，Rodriguez P A，Villdores D A，et al.Treatment of the dysfunction of the pelvic floor[J].Actas Urologicas Espanolas，2007，31（7）：719-731.

[5]嚴曉，覃彩芳，李青先，等.盆腔臟器脫垂動物模型的建立與適用性評價[J].中國實驗動物學報，2020，28（5）：668-674.

[6]嚴曉，覃彩芳，李青先，等.補中益氣湯對盆腔臟器脫垂模型大鼠子宮骶韌帶組織轉化生長因子β-3和微小核糖核酸-30d表達的影響[J].中華老年醫學雜志，2020，39（10）：1214-1218.

[7]張彩霞.補中益氣湯對Ⅰ度子宮脫垂患者POP-Q分度及臨床療效的影響[J].中醫藥導報，2016，22（8）：90-92.

[8]韓德利.子宮脫垂患者應用補中益氣湯加味結合針灸治療的效果研究[J].醫藥前沿，2016，6（31）：332-333.

[9]張曉帆.補中益氣湯治療子宮脫垂隨機平行對照研究[J].實用中醫內科雜志，2013，27（15）：34-35.

[10]王彩虹.中藥多成分藥代動力學的新方法和策略研究[D].北京：北京協和醫學院，2017.

[11]劉德，李選，王秀芳，等.基于網絡藥理學和分子對接技術探討升陽益胃湯治療新型冠狀病毒肺炎作用機制[J/OL].遼寧中醫藥大學學報：1-14[2021-04-04].http：//kns.cnki.net/ kcms/ detail/21.1543.R.2021 0401. 1107.009.html.

（收稿日期：2021-09-26）