紫錐菊中菊苣酸的萃取工藝研究

高瑩慧 岳鑫瀅 周揚(yáng) 張瑤 遲羽淳 揚(yáng)敏 張?zhí)戾a 李峰

摘要：目的 提高乙酸乙酯對菊苣酸的萃取效率，優(yōu)化一套經(jīng)濟(jì)高效適于工業(yè)放大生產(chǎn)的萃取工藝。方法 以菊苣酸的萃取率和純度為評價指標(biāo)，通過單因素實驗考察藥液濃度、藥液pH值、萃取次數(shù)、萃取劑用量、萃取時間、萃取攪拌時間、萃取攪拌轉(zhuǎn)速對萃取工藝的影響。結(jié)果 最佳萃取條件為藥液菊苣酸濃度為15 mg·mL-1，藥液pH=2，乙酸乙酯用量與藥液體積分?jǐn)?shù)比例為1∶1，萃取2次，每次萃取時間為40 min（攪拌15 min、靜置25 min），攪拌轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。在此條件下，菊苣酸純度為41.4 %，純度提高了13.0 %，萃取率為98.4 %。結(jié)論 該工藝穩(wěn)定可靠，操作簡便，適用于工業(yè)生產(chǎn)，可為紫錐菊中菊苣酸的工業(yè)萃取提供參考。

關(guān)鍵詞：紫錐菊;菊苣酸;萃取率;純度;單因素

中圖分類號：R284.2?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）02-0075-06

紫錐菊（Echinacea pupurea（L.）Moench）為菊科紫錐菊屬多年生草本植物[1]，主要含咖啡酸衍生物、多糖和糖蛋白及烷酰胺類化合物等[2]。菊苣酸作為咖啡酸衍生物中重要的、具代表性的化合物[3-4]，廣泛應(yīng)用于藥品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑和保健食品。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)紫錐菊提取物菊苣酸抗RSV療效顯著，在抗RSV新型候選藥物的開發(fā)中具有廣闊的前景。為菊苣酸抗RSV制劑生產(chǎn)提供高純度的原料來源，本實驗以紫錐菊醇提物為原料，以菊苣酸的純度及萃取率為指標(biāo)，探究菊苣酸的乙酸乙酯萃取工藝，旨在優(yōu)化出一套環(huán)保經(jīng)濟(jì)、簡便高效適用于工業(yè)化的萃取工藝方案。

1 材料與儀器

1.1 藥材 紫錐菊購自青州市康達(dá)中藥材種植專業(yè)合作社（批號：20190630），經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為菊科植物紫錐菊屬紫錐菊（Echinacea pupurea（L.）Moench）的干燥地上部分。菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究所，批號：111752-201703，純度≥97.60 %），乙酸乙酯（天津市富宇精細(xì)化工有限公司、批號：20190815、分析純）等。

1.2 儀器 Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），CPA 2250型電子分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司），pHS-3C型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），CSU-20型頂置攪拌器（上海小聰科技有限公司），SY-2000型旋蒸儀（上海亞榮生化儀器廠），TDL-5-A型低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），DZF型真空干燥箱（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司）。

2 實驗方法

2.1 菊苣酸的檢測方法

2.1.1 高效液相色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相0.2 %磷酸水（A）-乙腈（B），體積流量1.5 mL·min-1;檢測波長330 nm;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫條件見表1。

2.1.2 菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照2.1.1的色譜條件，分別取濃度為120、210、300 、360、480 μg·mL-1對照液，分別測定峰面積。以對照品濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（mAU）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=18.475X-626.932，r=0.9997，線性范圍：120～300 μg·mL-1。菊苣酸對照品標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖1所示。

2.2 供試液的制備 稱取紫錐菊藥材500 g于10 L圓底燒瓶中，以30 %乙醇提取液經(jīng)旋蒸濃縮水沉處理使藥液濃度為3 mg·mL-1，調(diào)pH=3上層析柱。收集30 %乙醇洗脫液，在50 ℃，70 r·min-1條件下旋蒸濃縮至無醇味，配置成濃度為15 mg·mL-1，pH=2的供試液。

2.3 萃取工藝單因素實驗

2.3.1 萃取濃度考察 取供試液配置成濃度分別為45、35、25、15、5 mg·mL-1的藥液，分別用等體積乙酸乙酯萃取2次，每次10 min，水相旋蒸濃縮（T=60 ℃，v=70 r·min-1）至無乙酸乙酯味，取樣經(jīng)HPLC檢測萃取率，有機(jī)相旋蒸濃縮（T=40 ℃，v=70 r·min-1）后水浴（T=60 ℃）揮去溶劑真空干燥（T=60 ℃，P=0.08 MPa），取樣經(jīng)HPLC檢測純度。

2.3.2 萃取pH考察 取供試液調(diào)pH分別為2、3、4、5，量取4份30 mL乙酸乙酯置于分液漏斗內(nèi)，分別取等體積不同pH藥液進(jìn)行萃取2次，萃后水相調(diào)至相應(yīng)pH，進(jìn)行第二次萃取，每次萃取10 min。

2.3.3 萃取比例考察 將乙酸乙酯用量與藥液體積分?jǐn)?shù)按1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的比例分配，分別量取15、30、60、90 mL乙酸乙酯置于分液漏斗中，再均加入30 mL的供試液，萃取2次，萃后水相調(diào)至相應(yīng)pH，每次萃取10 min。

2.3.4 萃取次數(shù)考察 量取30 mL乙酸乙酯及同等體積的供試液于燒杯內(nèi)，將萃取次數(shù)分為1、2、3進(jìn)行萃取。每次萃取完成后用6 mol·L-1 NaOH溶液調(diào)到pH=2，每次萃取10 min。

2.3.5 萃取時間考察 量取30 mL乙酸乙酯及同等體積的供試液于燒杯內(nèi)，分別萃取10 min、20 min、30 min、40 min、60 min，考慮萃取次數(shù)對萃取時間有影響，每個條件分別萃取2次和萃取3次。萃后水相調(diào)至相應(yīng)pH，再按照相應(yīng)時間和次數(shù)進(jìn)行萃取。

2.3.6 萃取攪拌時間考察 考慮工業(yè)生產(chǎn)實際情況，故對攪拌時間、攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)一步考察。量取30 mL乙酸乙酯及同等體積的供試液于燒杯內(nèi)，以100 r·min-1的攪拌轉(zhuǎn)速分別攪拌5、10、15、20 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗內(nèi)分別靜置35、30、25、20 min，萃取水相調(diào)pH=2，同樣條件進(jìn)行第2次萃取。

2.3.7 萃取攪拌轉(zhuǎn)速考察 量取30 mL乙酸乙酯及同等體積的供試液于燒杯中，分別以50、100、150、200 r·min-1轉(zhuǎn)速攪拌15 min，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗內(nèi)靜置25min，萃取水相調(diào)pH=2，同樣條件進(jìn)行第2次萃取。

3 結(jié)果

3.1 萃取濃度考察結(jié)果 測定不同藥液濃度對菊苣酸萃取率和純度的影響，結(jié)果見圖2

在萃取過程中，隨萃取原液濃度的減小，上層有機(jī)相顏色從紅棕色過渡到黃棕色，下層水相顏色由深紅棕色過渡到淺紅棕色。若萃取濃度太低需要消耗的有機(jī)溶劑增加，經(jīng)濟(jì)成本較高;若濃度過高，在濃縮過程中會造成菊苣酸的損失。當(dāng)藥液濃度為15 mg·mL-1時菊苣酸萃取率及純度均較高，故選擇藥液濃縮濃度為15 mg·mL-1。

3.2 萃取pH考察結(jié)果 測定不同藥液pH對菊苣酸萃取率和純度的影響，結(jié)果見圖3。

pH=2、3時有機(jī)相紅棕色;pH=4、pH=5時有機(jī)相為澄清的黃綠色。當(dāng)pH=2時，菊苣酸主要以分子形式存在，在酸水中的溶解度降低，在乙酸乙酯中溶解度較大，萃取率和純度較高。當(dāng)pH=4、5時大部分菊苣酸保留在水相，所以菊苣酸的萃取率和純度均較低。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，當(dāng)藥液為pH=2時菊苣酸萃取率及純度均較高，故選擇藥液pH=2。

3.3 萃取比例考察結(jié)果 測定乙酸乙酯用量與藥液體積分?jǐn)?shù)不同比例對菊苣酸萃取率和純度的影響，結(jié)果見圖4。

隨著乙酸乙酯比例的增加，上層有機(jī)相萃取顏色由淺黃棕色變?yōu)榧t棕色乙酸乙酯用量與藥液體積分?jǐn)?shù)比例為1：1時萃取率較高，純度最高;乙酸乙酯用量與藥液體積分?jǐn)?shù)比例為3∶1時，萃取率最高。綜合考慮在工業(yè)生產(chǎn)成本問題，選擇乙酸乙酯用量與藥液體積分?jǐn)?shù)比例為1∶1為最優(yōu)萃取條件。

3.4 萃取次數(shù)考察結(jié)果 測定萃取次數(shù)不同對菊苣酸萃取率和純度的影響，結(jié)果見圖5。

第1次萃取時，上層有機(jī)相呈澄清紅棕色，色淺于藥液，下層水相紅棕色;第2次萃取時，上層有機(jī)相橙黃色，下層水相顏色變淡，為淺紅棕色;第2次萃取時，上層有機(jī)相顏色變?yōu)槌吻宓臏\黃綠色，下層水相顏色較第二次萃取變淺。當(dāng)萃取次數(shù)較少時，有效成分不能完全萃出，萃取不完全，導(dǎo)致萃取率較低，純度較低，當(dāng)萃取次數(shù)為3次時，萃取率及純度均較高。

3.5 萃取時間考察結(jié)果 測定不同萃取時間對菊苣酸萃取率和純度的影響，結(jié)果見圖6～圖8。

當(dāng)萃取次數(shù)為2次時，上層有機(jī)相顏色呈淺紅棕色;萃取次數(shù)為3次時，上層有機(jī)相顏色呈黃綠色;萃取2次時菊苣酸基本被完全萃出。當(dāng)萃取時間過短時，有效成分不能完全萃出，萃取不完全，延長萃取時間有利于提高有效成分的萃取率和純度;根據(jù)實驗比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)萃取次數(shù)定為2次時，通過延長萃取時間，可以提高萃取效果，綜合考慮，故選擇萃2次，每次40 min。

3.6 萃取攪拌時間考察結(jié)果 測定不同攪拌時間對菊苣酸萃取率和純度的影響，結(jié)果見圖9。

隨著萃取攪拌時間的增加，上層有機(jī)相顏色為澄清的淺紅棕色，當(dāng)攪拌時間少于15 min時，菊苣酸和乙酸乙酯接觸不完全，進(jìn)入乙酸乙酯中的量較少，導(dǎo)致萃取率較低;若攪拌時間過長，會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。當(dāng)攪拌時間為15 min，萃取時間為25 min時，萃取率及純度最高。

3.7 萃取攪拌轉(zhuǎn)速考察結(jié)果 測定不同攪拌轉(zhuǎn)速對菊苣酸萃取率和純度的影響，結(jié)果見圖10。

隨著萃取攪拌轉(zhuǎn)速的增加，上層有機(jī)相顏色由黃棕色過渡到紅棕色，若萃取轉(zhuǎn)速較慢，菊苣酸和乙酸乙酯未能良好接觸，使萃取率較低;轉(zhuǎn)速過快，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為100 r·min-1時，菊苣酸萃取率及純度均較高，故選擇攪拌轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。

4 驗證實驗

4.1 萃取驗證1 不考慮攪拌時間及攪拌轉(zhuǎn)速的影響，進(jìn)行萃取驗證1。量取30 mL乙酸乙酯及同等體積pH=2、濃度為15 mg·mL-1的供試液于分液漏斗混勻后靜置，共萃取2次，每一次萃取40 min。第1次萃后水相調(diào)pH=2，進(jìn)行第2次萃取，水相、有機(jī)相處理后檢測分析，萃取結(jié)果見表2、圖11。

根據(jù)以上最優(yōu)條件，重復(fù)進(jìn)行3次平行實驗，得到菊苣酸的萃取率99.3 %，純度0為40.3 %。

圖11 菊苣酸萃取驗證1色譜圖

4.2 萃取驗證2 考慮攪拌時間及攪拌轉(zhuǎn)速的影響，進(jìn)行萃取驗證2。取pH=2、濃度為15 mg·mL-1供試液30 mL與同體積乙酸乙酯于燒杯內(nèi)以100 r·min-1轉(zhuǎn)速攪拌15 min，轉(zhuǎn)至分液漏斗內(nèi)靜置25 min，第1次萃取水相調(diào)pH=2，同樣方法進(jìn)行第2次萃取，水相、有機(jī)相處理后檢測分析，萃取結(jié)果見表3、圖12。

重復(fù)進(jìn)行3次平行實驗，萃取驗證2菊苣酸的萃取率為98.4 %，純度為41.4 %。

5 討論

通過對比萃取驗證1和萃取驗證2可以發(fā)現(xiàn)：在實驗室小試條件下，增加攪拌條件對萃取率影響不大，菊苣酸純度略有增加;說明攪拌不會造成菊苣酸的損失，在工業(yè)生產(chǎn)中采用攪拌的方式進(jìn)行萃取是可行的。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，攪拌萃取更有利于菊苣酸與乙酸乙酯充分接觸，使萃取更加充分，更符合工業(yè)化的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

通過多因素優(yōu)化菊苣酸的萃取工藝，得最優(yōu)萃取條件為藥液菊苣酸濃度為15 mg·mL-1，藥液pH=2，乙酸乙酯用量與藥液體積分?jǐn)?shù)比例為1∶1，萃取2次，每次萃取時間為40 min（攪拌15 min、靜置25 min）? ???，攪拌轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。在單因素考察中，菊苣酸的萃取率受藥液pH的影響最大，隨藥液pH的增加，萃取率由99.3 %下降到5.5 %，因此在工業(yè)生產(chǎn)中要嚴(yán)格控制藥液pH。

孟創(chuàng)鴿[4]用2倍量的正丁醇對菊苣酸進(jìn)行萃取，在50 ℃的條件下萃取40 min，所用萃取劑屬于有毒試劑，安全性低，本實驗所用的乙酸乙酯更加符合安全生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn);吳啟林等[5]以萃取率為指標(biāo)，以pH=3濃度C=2.5 mg·mL-1的藥液為原料，用同體積乙酸乙酯萃取4次，萃取率為96.8 %，菊苣酸純度在20%～30%，相比之下，本工藝萃取藥液濃度較高，萃取次數(shù)少，節(jié)約成本且提高了萃取效率。本工藝方便操作，提高了菊苣酸的純度與萃取率，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)，為后期生產(chǎn)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]杜妍，甘春麗，曾慶軒，等.紫錐菊中酚酸類化合物的合成[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，51（3）：200-205.

[2]李晶，聶斌，武力，等.引種紫錐菊中菊苣酸的定性定量分析[J].藥物分析雜志，2011，31（9）：1804-1807.

[3]竇德明，崔樹玉，曹永智，等.引種紫錐菊有效成分菊苣酸含量研究[J].中草藥，2001（11）：30-31.

[4]孟創(chuàng)鴿.菊苣中菊苣酸的提取純化及生理活性的研究[D].咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[5]吳啟林，袁其朋，陳養(yǎng)文.紫錐菊中菊苣酸提取純化工藝研究[J].中草藥，2004，35（9）：995-997.

（收稿日期：2021-09-03）