亞臨界萃取與分子蒸餾結(jié)合提取艾葉精油及其成分分析

申艷紅，李志祥，趙占強(qiáng)，鄭永軍，張換平，祁鯤

(1.安陽工學(xué)院 a.化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院；b.河南省亞臨界高效萃取重點實驗室，河南 安陽 455000;2.河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司，河南 安陽 455000)

艾草，為菊科多年生草本藥用植物，在我國醫(yī)書古籍中多有記載，在民間也有廣泛應(yīng)用，目前在湖北蘄春、河南南陽、河南安陽湯陰等地都已形成規(guī)模化種植[1].精油作為艾葉的主要活性成分，是近年來研究熱點之一，具有抗菌、抗病毒、平喘鎮(zhèn)咳、抗氧化以及驅(qū)殺蚊蟲等功效[2-3].艾葉精油成分復(fù)雜，主要包括單萜類化合物及其衍生物、倍半萜類及其衍生物，還有少量的醇、醛、酮等.

目前艾葉揮發(fā)油提取工藝研究較多的有水蒸氣蒸餾法[4]、有機(jī)溶劑萃取法[5]、微波和超聲波輔助萃取法[6]、超臨界CO2萃取法[7]等.其中以水蒸氣蒸餾法應(yīng)用較多，但是該法溫度較高，精油長時間與水共熱中一些熱敏性組分嚴(yán)重變性，產(chǎn)品味道變異，保健及藥用功能減退.有機(jī)溶劑萃取法所需設(shè)備簡單、投資小，精油提取率高，但是此法提取的植物精油純度較低，主要是因為植物體中的樹脂、蠟等雜質(zhì)會同時被提出，并且產(chǎn)品中殘留溶劑難以除去等.微波和超聲波輔助萃取法存在著溶劑不易脫除、樣品處理量小、難以實現(xiàn)工業(yè)化等缺點.超臨界CO2萃取法優(yōu)點較多，操作溫度偏低，提取充分并能夠避免精油中的組分分解或者流失，但是該方法所得精油同樣含有較多的蠟質(zhì)，并且需要高壓操作，投資大，運行成本較高，并不適合工業(yè)化生產(chǎn).因此，研究艾葉揮發(fā)油新的提取方法具有重要的產(chǎn)業(yè)化意義.

亞臨界低溫萃取技術(shù)是一種新型萃取與分離技術(shù).該技術(shù)常用的幾種溶劑常壓沸點低于0 ℃，在一定壓力和溫度條件下以液化狀態(tài)存在，稱為亞臨界流體.利用亞臨界流體作為萃取劑，在密閉、無氧、低壓的壓力容器內(nèi)，固體物料中可溶性成分轉(zhuǎn)移到液態(tài)的萃取劑中，室溫下減壓脫除溶劑得到目標(biāo)產(chǎn)物[8].亞臨界低溫萃取技術(shù)可以最大限度地保留天然產(chǎn)物中的熱敏性、易揮發(fā)性、易水解、易氧化組分，在天然產(chǎn)物，尤其是精油的提取方面具有獨特的優(yōu)勢[9].

分子蒸餾是一種在高真空、低于沸點條件下，利用分子熱運動程度不同的特點完成的分離過程.分子蒸餾在高真空下進(jìn)行，且被蒸餾物受熱時間短，可確保一些熱敏性、易氧化或易水解的組分不會發(fā)生變質(zhì).目前分子蒸餾在精油的分離純化方面已有較多的應(yīng)用.例如香樟精油、洋甘菊精油的分離純化等[10].

因此，將亞臨界低溫萃取與分子蒸餾相結(jié)合，可確保整個提取分離過程在無水、無氧及較低溫度下進(jìn)行，從而實現(xiàn)精油的高效保質(zhì)提取.本文重點采用亞臨界低溫萃取與分子蒸餾相結(jié)合的方法，對四大名艾之一的湯陰北艾艾葉精油進(jìn)行提取分離.作為對比，對同一批艾葉采用水蒸氣蒸餾提取精油.并采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase micro extraction,HS-SPME)與氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)結(jié)合的方法，對艾葉和所得精油分別進(jìn)行成分分析.通過譜庫檢索加人工解析、保留指數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品比對3種方法，對以上艾葉和兩種提取方法所得精油成分進(jìn)行定性和定量分析，并對兩種提取方法所得精油成分與艾葉頂空固相微萃取所得成分進(jìn)行對比，以判斷它們與艾葉原有成分的接近程度，為艾葉精油的工業(yè)提取提供參考依據(jù).

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

北艾：產(chǎn)地為河南安陽湯陰，端午后10 d收割，由湯陰縣醫(yī)藥辦提供.正構(gòu)烷烴(C6-C30)、1,8-桉油精和水合檜烯(純度>98%,sigma-aldrich公司).丁香酚、石竹烯、石竹素(純度>97%,瑪雅試劑有限公司).樟腦、4-萜烯醇(純度>97%,上海麥克林生物有限公司).vCBE-5L型亞臨界流體萃取實驗室成套裝置(河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司).VTA VKL 70-5型分子蒸餾設(shè)備(德國瑞達(dá)有限公司).揮發(fā)油提取器(北京博美玻璃有限公司).Agilent 7980A-5975C GC-MS聯(lián)用儀(美國安捷倫公司),50/30 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取纖維頭(CAR/PDMS/DVB,美國SUPELCO公司).

1.2 方 法

1.2.1亞臨界萃取-分子蒸餾法提取精油

亞臨界萃取:取陰干艾葉5 000 g，粉碎至20～30目，裝入萃取罐內(nèi)，采用丁烷為萃取溶劑，利用壓力差將溶劑罐內(nèi)丁烷約15 L注入萃取罐內(nèi)，萃取溫度為40 ℃，萃取壓強(qiáng)為0.45 MPa，萃取時間為20 min.萃取液從萃取罐進(jìn)入分離罐.分離罐內(nèi)進(jìn)行減壓蒸發(fā).時間為20～30 min.汽化后的溶劑經(jīng)壓縮機(jī)重回溶劑罐.分離罐底部有液體富集，從分離罐底部排出，室溫下放置得艾葉浸膏145 g.

分子蒸餾:取艾葉浸膏145 g，加入進(jìn)料瓶中，進(jìn)料瓶溫度為70 ℃.關(guān)閉進(jìn)料閥，打開排氣閥，運行真空泵，直至壓強(qiáng)降至100 Pa，開始加料.蒸餾溫度為70 ℃，刮膜速度為200 r/min，進(jìn)料速度為2 mL/min，冷卻水溫度為3 ℃.進(jìn)料完畢后，停止刮膜電機(jī).隨后關(guān)閉真空泵.靜置2 h，在輕組分瓶中，有淺黃色液體富集，將其取出，液體具有特殊清香氣味.測量其約為12.71 g.

1.2.2水蒸氣蒸餾法提取精油

將陰干的艾葉500 g，粉碎后加入揮發(fā)油提取器中，加入約1 500 mL蒸餾水，浸泡過夜后進(jìn)行水蒸氣蒸餾6 h，得到有特殊氣味的藍(lán)綠色液體約0.66 g.

1.2.3艾葉精油得率的計算

艾葉精油得率=(提取精油質(zhì)量/艾葉質(zhì)量)×100%.

1.2.4艾葉及精油成分GC-MS分析條件

固相微萃取.艾葉：將艾葉粉碎后，取5 g置于20 mL頂空瓶中，擰緊瓶蓋.60 ℃下平衡5 min后，用固相微萃取頭60 ℃下萃取30 min，然后于進(jìn)樣口解吸5 min.精油：將亞臨界萃取-分子蒸餾所得精油和水蒸氣蒸餾所得精油分別置于20 mL頂空瓶中，擰緊瓶蓋.60 ℃下平衡5 min后，用固相微萃取頭60 ℃下萃取30 min，然后于進(jìn)樣口解吸5 min.

GC條件:色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He，流速1 mL/min，進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比20∶1；進(jìn)樣溫度為250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃，10 ℃/min升至70 ℃，保持2 min，5 ℃/min升至125 ℃，保持2 min，10 ℃/min升至210 ℃，保持2 min，10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min.

MS條件:EI電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍30～400 m/z.

1.2.5數(shù)據(jù)分析

按上述GC條件和MS條件進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析[11]，獲得艾葉精油的總離子流圖，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù).

采用NIST譜庫檢索、保留指數(shù)(retention index,RI)和標(biāo)準(zhǔn)品比對3種方法進(jìn)行定性分析.質(zhì)譜定性是通過人工解析并使用計算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫NIST 08進(jìn)行對照確定.保留指數(shù)定性是將正構(gòu)烷烴混標(biāo)溶液，在與艾草成分分析相同的氣相色譜-質(zhì)譜條件下條件進(jìn)行檢測，測得相應(yīng)的保留時間，根據(jù)(1)式計算揮發(fā)性成分的保留指數(shù)，并與保留指數(shù)庫中的數(shù)據(jù)對比從而確定物質(zhì)成分.程序升溫分析保留指數(shù)計算：

(1)

式中：RI為保留指數(shù)，n和n+1分別為未知化合物流出前后正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；t為未知化合物保留時間，tn和tn+1為相應(yīng)正構(gòu)烷烴的保留時間.計算得到各化合物的RI，并與文獻(xiàn)值對照，絕對值相差30以內(nèi)的確定為同一化合物.

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種提取方法所得艾葉揮發(fā)油得率

上述水蒸氣蒸餾精油得率為0.13%，亞臨界萃取-分子蒸餾結(jié)合提取精油得率為0.25%.用亞臨界萃取-分子蒸餾法制得精油的得率遠(yuǎn)高于水蒸氣蒸餾法的得率.采用亞臨界萃取-分子蒸餾方法，在萃取過程和脫溶過程，溫度低于40 ℃，分子蒸餾過程，溫度為70 ℃，均低于水蒸氣蒸餾溫度100 ℃.并且整個操作過程保持了無水、無氧的密閉條件.

2.2 揮發(fā)油成分對比及分析

按上述HS-SPME-GCMS方法分別對艾葉、亞臨界萃取-分子蒸餾提取精油和水蒸餾提取的精油進(jìn)行測試，采用NIST譜庫檢索加人工解析、保留指數(shù)(retention index,RI)和標(biāo)準(zhǔn)品比對進(jìn)行定性或者定量分析.其總離子流色譜圖如圖1所示，成分分析結(jié)果見表1.

表1 艾葉和精油成分的HS-SPME-GCMS 分析結(jié)果

續(xù) 表

從圖1可以看出，以上采用亞臨界萃取-分子蒸餾和水蒸氣蒸餾法所得精油化學(xué)成分有明顯差別，其中亞臨界萃取-分子蒸餾得到的艾葉精油成分與艾葉直接進(jìn)行頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用檢測得到的揮發(fā)性成分及組成很接近，而用水蒸氣蒸餾法所得精油成分與艾葉頂空固相微萃取測試所得成分差別較大.

從表1分析結(jié)果可以看出，艾葉、亞臨界萃取-分子蒸餾精油和水蒸氣蒸餾精油中能夠確定結(jié)構(gòu)且質(zhì)量分?jǐn)?shù)>0.1%的組分共50種，三者共有成分32種.其中艾葉直接進(jìn)行頂空固相微萃取后測得其主要成分有45種，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的5種成分是：1,8-桉油精(16.48%)、龍腦(9.71%)、反式水合檜烯(9.09%)、順式水合檜烯(7.07%)、4-萜烯醇(6.43%).通過亞臨界萃取-分子蒸餾所得精油含42種主要成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的5種成分是：1,8-桉油精(29.2%)、反式水合檜烯(16.54%)、樟腦(7.98%)、順式水合檜烯(5.43%)、龍腦(4.63%).水蒸氣蒸餾所得精油含有37種主要成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的5種成分是：1,8-桉油精(23.57%)、艾醇(14.28%)、傘花烴(11.04%)、蒿醇(7.00%)、龍腦(4.67%).從以上測試結(jié)果看出，亞臨界萃取-分子蒸餾所得精油與艾葉所包含主要成分接近，而水蒸氣蒸餾所得精油組分與艾葉所含主要組分差別較大.并且水蒸氣蒸餾所得精油高沸點組分及其含量明顯少于艾葉或者亞臨界萃取-分子蒸餾提取精油，如紫蘇醛、丁香酚、古巴烯和β-石竹烯在水蒸氣蒸餾法所得精油中含量遠(yuǎn)小于艾葉和亞臨界萃取-分子蒸餾提取精油，而沸點更高的金合歡烯、α-石竹烯、α-蛇床烯、桉油烯醇等未檢出或質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%.高沸點組分精油主要包含倍半萜類，如倍半萜烯，倍半萜醇等，目前認(rèn)為這些分子往往具備抗腫瘤、抗病毒、抗菌等方面的藥理作用[12].

采用兩種提取方法所得精油和艾葉中，都含有桉油精、樟腦、龍腦、石竹烯等成分.但是在艾草和亞臨界萃取-分子蒸餾所得精油中，都有含量較高的水合檜烯，反式水合檜烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.09%和16.54%，順式水合檜烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.07%和5.43%，而水蒸氣蒸餾所得精油中，順式水合檜烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.28%，反式水合檜烯未檢測到.兩者明顯差別的原因推測是由于水蒸氣蒸餾過程中，由于高溫條件下長時間水煮導(dǎo)致水合檜烯發(fā)生了水解重排等反應(yīng)[13].而水合檜烯被應(yīng)用于化妝品、香水、洗發(fā)劑、香皂以及各種洗滌劑等，且已經(jīng)被實驗證明具有較高的抗炎活性，可使促炎細(xì)胞因子的釋放減少[14].水合檜烯還具有抗焦慮作用，改善癌癥化療導(dǎo)致的毒副作用等[15-16].艾葉中含有大量的反式水合檜烯和順式水合檜烯為首次通過實驗證實，在文獻(xiàn)中未見相關(guān)報道.另外一些組分在水蒸氣蒸餾精油中的含量也明顯低于艾葉或者亞臨界提取所得精油的含量.例如，β-石竹烯在艾葉和亞臨界萃取-分子蒸餾所得精油中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.05%和1.57%，而在水蒸氣蒸餾所得精油中僅含0.33%.蘑菇醇在艾葉和亞臨界萃取-分子蒸餾所得精油中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.21%和1.67%，而在水蒸氣蒸餾所得精油中質(zhì)量分?jǐn)?shù)<0.1%.松香芹醇在艾葉和亞臨界萃取-分子蒸餾所得精油中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.35%和0.63%，而在水蒸氣蒸餾所得精油中質(zhì)量分?jǐn)?shù)<0.1%.丁香酚在艾葉和亞臨界萃取-分子蒸餾所得精油中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.49%和0.28%，而在水蒸氣蒸餾所得精油中質(zhì)量分?jǐn)?shù)<0.1%.采用亞臨界萃取-分子蒸餾的方法得到的艾葉精油，更好地保留艾葉的原有成分，避免了水蒸氣蒸餾過程中由于高溫和水煮使精油組分發(fā)生水解、氧化和重排等反應(yīng).

從以上檢測分析結(jié)果還可看出，所用的湯陰北艾不含側(cè)柏酮.而側(cè)柏酮是已知的具有肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)毒性的成分，國外從20世紀(jì)60年代開始對食品中側(cè)柏酮含量進(jìn)行限制[17].湯陰北艾不含側(cè)柏酮，可以避免艾葉使用過程中帶來的神經(jīng)毒性等毒副作用.

3 結(jié) 論

本研究首次通過亞臨界萃取-分子蒸餾法相結(jié)合提取艾葉精油，可以實現(xiàn)精油在無水條件下的低溫提取和分離，不會影響熱敏性物質(zhì)的天然活性，實現(xiàn)了精油的保質(zhì)、高效提取.所得精油香氣純正，與天然艾葉較為接近.并且亞臨界萃取-分子蒸餾法精油得率顯著高于水蒸氣蒸餾法.該方法為艾葉和其他富含揮發(fā)油的植物精油高效提取分離提供了科學(xué)依據(jù)和可靠的工業(yè)化生產(chǎn)條件.

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用，對以上兩種方法所得樣品進(jìn)行測試分析，并與艾葉進(jìn)行比對，結(jié)果表明，亞臨界萃取-分子蒸餾所得艾草精油，更好地保留艾草揮發(fā)性成分,并且該法所得精油中，高沸點組分高于水蒸氣蒸餾所得精油.通過艾葉、亞臨界萃取-分子蒸餾精油和水蒸氣蒸餾法提取精油的比較，首次發(fā)現(xiàn)了在艾葉中存在較多的水合檜烯，并且可通過亞臨界萃取-分子蒸餾結(jié)合的方法，在精油中得以保留.亞臨界萃取-分子蒸餾技術(shù)為艾葉精油的高效保真提取提供了一種新方法，對艾葉等資源的開發(fā)利用具有重要意義.