NLRP3炎癥小體泛素化調控的研究進展

許二平，汪保英，栗俞程，白明

(河南中醫藥大學 河南省仲景方藥現代研究重點實驗室;中醫藥科學院，鄭州 450046)

炎癥小體是機體抵抗病原體侵害和識別自身危險信號的重要分子結構.當細胞受到病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或者危險相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)刺激時，炎癥小體活化，促使白細胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和IL-18等促炎細胞因子成熟釋放，誘導細胞焦亡，參與固有免疫防御[1].NLRP3炎癥小體是迄今為止研究最多最廣泛的炎癥小體[2]，其激活的分子機制及其與疾病發病機制的關系是新興的研究熱點.泛素化和去泛素化在NLRP3降解或激活中起著至關重要的作用[3-5].泛素E3連接酶和去泛素化酶靶向治療成功地用于癌癥的治療[6].因此，全面了解泛素系統對NLRP3炎癥小體級聯反應的調節有助于NLRP3炎癥小體介導疾病的靶向治療.

1 NLRP3炎癥小體的組成、結構及功能

NLRP3炎癥小體是由識別炎癥的NOD樣受體3(NLRP3)、接頭蛋白即凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和效應分子半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)組成的炎性復合體，其主要在外周巨噬細胞、單核細胞、常規樹突狀細胞和中樞小膠質細胞中表達[7].NLRP3受體包含3個結構域：氨基末端pyrin結構域(PYD)、NACHT結構域(Nucleotide-binding and Oligomerization Domain,NOD)和一個羧基末端富含亮氨酸的重復結構域(Leucine-rich Repeat,LRR)[8-10].由于NOD具有三磷酸腺苷(ATP)酶活性，它對NLRP3的自締合和功能至關重要. LRR能夠通過折疊回到NACHT結構域上進行自動抑制.ASC由2個結構域組成：氨基末端PYD結構域和羧基末端半胱天冬酶募集結構域(caspase recruitment domain,CARD)[11].Caspase-1由一個氨基末端CARD結構域和2個催化結構域組成，后者由一個中央大催化(p20)結構域和一個羧基末端催化小亞基(p10)結構域組成.

NLRP3炎癥小體的激活一般認為需要2種信號——啟動信號或稱第1信號，以及激活信號或稱第2信號[10].Tumor necrosis factor α(TNF-α)[12],IL-1[13],毒素(MPTP)[14],DAMPs,PAMPs,模式識別受體(Pattern recognition receptor,PRR).例如Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)和NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)配體[15]都可作為啟動信號.最常見的NLRP3炎癥小體激活的第2信號包括線粒體活性氧(mtROS)、K+流出、Ca2+流通、錯誤折疊蛋白、溶酶體破壞、ATP、毒素、顆粒物質和病毒RNA等[16-19].靜息狀態下的巨噬細胞中NLRP3的基礎水平不足以激活NLRP3炎癥小體，Pro IL-Iβ也不會穩定表達，而巨噬細胞經PAMPs誘導后，激活轉錄因子NF-κB，從而誘導NLRP3和pro-IL-1β的轉錄，完成啟動過程[12,20].激活信號出現后，NLRP3的LRR與其配體結合后NLRP3發生結構變化，暴露出NACHT結構域，通過ATP聚合形成高度有序的NLRP3蛋白寡聚體，并募集ASC及Caspase形成復雜的復合物——炎癥小體(inflammasome)，產生活化的Caspase-1.具體過程為，ASC的PYD結構域與NARP3中的PYD相結合，而其CARD結構域通過同型結構募集Caspase-1的CARD結構域[21-22].Caspase-1也稱IL-1β轉化酶，活化的Caspase-1能將細胞內不具活性的IL-1β前體在116位天冬氨酸裂解，形成活化的成熟IL-1β分泌到胞外[23],繼而誘發炎癥級聯反應[24-25](如圖1所示).

2 泛素化-NLRP3的翻譯后修飾

NLRP3炎癥小體的激活可通過翻譯后修飾(Post-translation modification,PTM)(如磷酸化[26]、泛素化[27-28]、蘇莫?；痆29]、烷基化[30]和S-亞硝基化[31])進行嚴密控制與調節.其中，泛素化作為一種多功能PTM，在NLRP3介導的炎癥免疫反應中起著關鍵的調節作用[32-33].泛素(Ubiquitin，Ub)是一種由76個氨基酸組成的蛋白質，通常通過異肽鍵與底物蛋白質的賴氨酸殘基結合[34].泛素化是指泛素分子在一系列酶的作用下，對靶蛋白進行特異性修飾的過程.這些酶包括泛素激活酶(E1)、泛素結合酶(E2)和泛素連接酶(E3)[35].泛素化級聯反應開始于E1酶激活Ub的C端以形成硫酯鍵.然后通過反式硫酯化將Ub轉移到E2酶的活性半胱氨酸位點.最后，Ub被E3連接酶轉移到底物蛋白上，并促進Ub的C端甘氨酸和底物蛋白的賴氨酸殘基之間形成異肽鍵.泛素本身包含7個賴氨酸殘基(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63)和一個蛋氨酸[34].根據泛素的數量和附著類型，泛素化可以分為以下3種類型：如果泛素化發生在單個殘基中，則稱為單泛素化；如果在同一蛋白質中但在不同位點發生多個泛素化，則稱為多單體泛素化；當多個泛素化發生在一個位點時，它被稱為聚泛素化.

3 泛素化對NLRP3炎癥小體的調控

泛素化和去泛素化在NLRP3炎癥小體的降解或激活中起著至關重要的作用[3-4].NLRP3在靜息巨噬細胞中泛素化，并在啟動和激活時去泛素化[36].目前已發現了2個E1家族，約40個E2和600個E3家族[37-39].

3.1 NLRP3的泛素化負性調控

目前發現只有E3泛素連接酶通過靶向NLRP3本身或炎癥小體的其他成分，如ASC和caspase-1，實現對炎癥小體的負性調控，其主要機制之一是通過蛋白酶體降解途徑來控制NLRP3水平而實現.多個E3泛素連接酶(包括MARCH7,TRIM31,Cbl-b,RNF125,FBXL2等)已報道作為NLRP3炎癥小體的內源性負性調節因子.多巴胺受體D1可通過E3連接酶MARCH7誘導NLRP3的泛素化和降解來抑制NLRP3炎癥小體的激活，緩解神經毒素誘導的神經炎癥、LPS誘導的全身炎癥和單鈉尿酸鹽晶體誘導的腹膜炎[40].TRIM31可以直接結合NLRP3，促進靜息和活化巨噬細胞中NLRP3 K48聚泛素化和蛋白酶體降解，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活；TRIM31缺乏促進了NLRP3炎癥小體的激活，增強了IL-1β的分泌，從而加重了體內明礬誘導的腹膜炎[41].在NLRP3炎癥小體受刺激后，Cbl-b通過其泛素相關域與NLRP3 LRR域中K63連接的泛素鏈結合.這種結合導致NLRP3的Nucleotide-binding domain(NBD)結構域中K496位點的K48連接泛素化，并誘導其蛋白酶體降解[42-43].E3泛素連接酶阻止NLRP3炎癥小體激活的其他主要機制是通過將NLRP3保持在失活狀態，與蛋白酶體降解無關，如ARIH2,Cullin1,Parkin等.E3連接酶ARIH2過表達促進NLRP3泛素化并抑制NLRP3炎癥小體激活；相反，使用CRISPR/Cas9基因組編輯刪除內源性ARIH2可抑制NLRP3泛素化并促進NLRP3炎癥小體激活，導致ASC寡聚化、pro-IL-1β加工和IL-1β生成[27].在炎癥小體啟動時，Cullin1結合并泛素化NLRP3，使其保持非活動狀態.Parkin誘導泛素修飾酶抗凋亡信號蛋白20，后者可通過抑制核因子κB (Nuclear factor-κB,NF-κB)活化來抑制NLRP3炎癥小體活化，而Parkin缺陷細胞NLRP3激活增加[44-45].

3.2 NLRP3的泛素化正性調控

E3泛素連接酶還可作為正性調節因子促進炎癥小體的激活，如Pellino2,TRAF6和HUWE1.Pellino2在NLRP3調節中起雙重作用.LPS導致pellino-2與NLRP3的關聯并促進NLRP3 K63連接的聚泛素化.這種泛素化可能會促進NLRP3炎癥小體的激活[46].另一方面，Pellino-2也可以抑制NLRP3炎癥小體的激活.在野生型骨髓衍生巨噬細胞中，Pellino-2泛素化IL-1R相關激酶1(IRAK1)，IRAK1的泛素化可以抑制NLRP3炎癥小體的激活[46].TRAF6通過其泛素E3連接酶活性與NLRP3炎癥小體的非轉錄啟動相關[47]，可視為TLR介導的NLRP3炎癥小體激活的正性調節因子.HUWE1與NLRP3的相互作用導致NLRP3的K27連接聚泛素化.這有利于NLRP3組裝、ASC斑點形成和caspase-1激活，亦可視為NLRP3炎癥小體的正性調節因子[48].

3.3 NLRP3的去泛素化調控

去泛素化酶與E3泛素連接酶一起在控制NLRP3炎癥小體的激活方面發揮著至關重要的作用.去泛素化酶負責通過裂解蛋白質上賴氨酸殘基和泛素C端甘氨酸之間的異肽鍵從蛋白質中去除泛素鏈[49].目前已經發現的大約100種去泛素化酶可分為7大類：1)泛素特異性蛋白酶(USP)，2)泛素C端水解酶(UCH)，3)卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)，4)Machado-約瑟夫病蛋白結構域蛋白酶(MJD)，5)單核細胞趨化蛋白誘導蛋白(MCPIP)，6)含有MIU的新型去泛素化酶家族(MINDY)，7)JAMM/MPN結構域相關金屬肽酶(JAMMS).首次發現去泛素化酶可作為NLRP3炎癥小體的正性調節因子是源于去泛素化酶抑制劑G5,PR619,bAP15和WP1130顯示出阻斷NLRP3誘導的caspase-1激活和IL-1β釋放的作用[3,50].以下去泛素化酶已被證明可以調節NLRP3炎癥小體的激活.BRCC3可以直接與NLRP3結合并通過其去泛素化有利于NLRP3炎癥小體的激活；BRCC3抑制劑G5阻斷NLRP3炎癥小體的激活[4]，同樣，BRCC3/ABRO1的缺失會減輕NLRP3相關的炎癥性疾病，如腹膜炎或敗血癥[51].由此驗證了BRRC3作為NLRP3炎癥小體的正性調節因子作用.在巨噬細胞暴露于炎癥小體激活信號后，USP7和USP47的酶活性增強，表明這些信號在翻譯后水平調節去泛素化酶活性，而化學抑制和敲除USP7和USP47均可通過抑制ASC寡聚化和斑點形成而阻止NLRP3炎癥小體的形成[50,52].泛素特異性肽酶1相關因子1(UAF1)是3種去泛素化酶復合物的組成部分，即UAF1/USP1,UAF1/USP12和USP1/USP46[53].最近的一項研究表明UAF1/USP1可以去除NLRP3的K48連接的泛素化，阻止NLRP3的蛋白酶體降解并增加NLRP3 mRNA和蛋白質的表達，從而促進NLRP3炎癥小體的激活；此外，UAF1/USP12和UAF1/USP46復合物增加p65表達，促進NF-κB活化并增加NLRP3和IL-1β表達水平；而體內/體外UAF1的缺失導致NLRP3炎性體的激活和IL-1β的分泌減少[54].到目前為止，發現的首個具有炎癥小體負性調節能力的去泛素化酶是屬于OTU蛋白酶家族的A20.A20是NF-kB通路的關鍵負性調節因子，其表達水平通過激活該通路而上調.A20缺失的巨噬細胞表現出自發的NLRP3炎癥小體激活，A20缺失的小鼠會出現自發性侵蝕性多關節炎，類似于患者的類風濕性關節炎[55-56].最近的一項研究發現，屬于JAMM家族的信號轉導接頭分子結合蛋白(STAMBP)亦具有負性調節NLRP3炎癥小體激活的能力.STAMBP缺乏會增加ASC斑點和活性Caspase-1水平，同時IL-1β基因表達和細胞因子水平亦顯示增加[57].

4 NLRP3泛素化的靶向治療

NLRP3炎癥小體與炎癥性疾病之間的直接聯系使其成為突出的治療靶標[15].NLRP3炎癥小體被認為是應激和抑郁癥之間的橋梁，發揮著將心理應激轉化為炎癥反應的關鍵作用，在抑郁癥的發病機制中占據著重要地位[58].NLRP3炎癥小體與阿爾茨海默病[59]、帕金森病[60]、動脈粥樣硬化、2型糖尿病、痛風性關節炎等[19]老年性、神經退行性疾病的發病機制有關(見圖2).NLRP3炎癥小體過度激活導致IL-1β活化可能是阿爾茨海默病、糖尿病、抑郁癥等多種炎癥疾病的共同致病因素[61].NLRP3炎癥小體過度激活會導致多發性硬化癥[62]、自身免疫性腦脊髓炎[63]等多種自身免疫性疾病.NLRP3炎癥小體還與多種癌癥(例如，乳腺癌、結腸癌、胃腸道癌、黑色素瘤)有關[64-65].泛素介導的翻譯后修飾激活NLRP3炎癥小體是尋找控制NLRP3炎癥小體激活治療靶點的新興領域.研究發現，泛素系統可成為治療不同形式癌癥和神經退行性疾病的潛在治療靶點[66-67].泛素蛋白酶體系統調節劑/抑制劑(例如，硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、馬里佐米)已成功用于癌癥治療或臨床試驗[68-71].最有潛力作為NLRP3炎癥小體抑制劑的MCC950,OLT1177,MNS,CY-09和BOT4-one等小分子目前正在進行臨床前或臨床試驗[30,72-76]，其在NLRP3炎癥小體相關疾病中的治療效果值得期待.

5 結論與展望

NLRP3炎癥小體是迄今為止研究最多最廣泛的炎癥小體，其激活的分子機制及其與疾病發病機制的關系是新興的研究熱點.激活信號出現后，NLRP3發生結構變化，并募集ASC及Caspase形成復雜的復合物——炎癥小體，產生活化的Caspase-1.后者將IL-1β前體轉化為成熟的IL-1，繼而誘發炎癥級聯反應.泛素化和去泛素化在NLRP3降解或激活中起著至關重要的作用.目前發現能調控NLRP3炎癥小體的泛素化酶為E3泛素連接酶，其負性調控NLRP3炎癥小體激活的主要機制為蛋白酶體降解作用從而降低NLRP3水平，或者將NLRP3保持在失活狀態，與蛋白酶體降解無關.E3泛素連接酶亦可正性調控NLRP3炎癥小體的激活.去泛素化酶與E3泛素連接酶一樣，亦存在正/負性調控NLRP3炎癥小體激活的作用.

抗感染治療作為防治抑郁癥等炎癥性疾病的新方向、新角度，NLRP3炎癥小體泛素化調控作為防治炎癥性疾病的新靶點，前景廣闊.但目前對NLRP3炎癥小體激活的確切調控機制仍不清楚，難以減少過度的免疫抑制作用增加臨床上感染的風險.如何解決副作用和非靶向作用是推廣NLRP3泛素化靶向治療的關鍵問題.