Gasdermin E多肽抑制劑對卵巢癌化療誘導腸道損傷的 改善作用

李婷婷，劉申平，杜 明

復旦大學附屬婦產科醫院婦產科，上海 200011

卵巢癌是目前致死率最高的婦科腫瘤［1］，化療對于延長患者生存和減少卵巢癌復發有重要作用［2］。而有80%～90%的卵巢癌患者在接受順鉑化療后出現消化道不良反應［3］，常表現為惡心、嘔吐、體質量下降、食欲減退及腹瀉等［4］。目前針對化療相關腸道損傷，仍以止吐、補液、抑制消化道炎癥及給予益生菌等對癥支持治療為主［5-6］，尚無針對化療相關腸道損傷的特異性藥物。

近年來研究發現順鉑、博來霉素等化療藥物可通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（caspase-3）/gasdermin E（GSDME）途徑誘導細胞焦亡而導致化療相關不良反應，如體質量降低、肺部炎癥與腸道絨毛組織破壞等［7］。細胞焦亡是一種新發現的細胞程序性死亡方式［8］，而GSDME 可被活化的caspase-3 切割并釋放具有造孔性的 GSDME N-末端結構域進而誘發細胞焦亡［7］。 GSDME在多數腫瘤細胞中表達量很低，但是在正常細胞中廣泛高表達［9］。因此，GSDME可作為改善化療相關腸道損傷，而不影響化療療效的潛在治療靶點。目前已有關于在正常細胞或其他腫瘤中進行GSDME基因敲除或應用caspase抑制劑的研究［10-13］，但尚鮮見在卵巢癌模型中應用GSDME特異性抑制劑的報道。

因此，本研究針對caspase-3在GSDME的剪切位點設計多肽抑制劑，應用正常小鼠和卵巢癌移植小鼠，研究GSDME抑制劑對順鉑抗腫瘤效果和誘導腸道損傷的影響，為臨床研發既不影響順鉑化療效果又能減輕化療相關腸道損傷的藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑采用雌性C57BL/6小鼠（6～7周齡，體質量17～21 g），將其飼養于上海南方模式生物科技股份有限公司SPF級動物房。卵巢癌細胞株 ID8獲贈于復旦大學附屬婦產科醫院劉海鷗實驗室。順鉑購于Sigma公司；GSDME多肽抑制劑Z-DMLD-FMK由GLS公司構建（圖1）；GSDME抗體購于Abcam公司；HRP標記的β-actin抗體購于Bioworld公司。轉染細胞的帶嘌呤霉素抗性luciferase過表達慢病毒購于吉凱基因。實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司，RMPI 1640培養液、胎牛血清、胰酶溶液購于Gibco公司，D-熒光素鉀鹽購于啟維益成，嘌呤霉素購于Clontech公司。

圖1 GSDME的caspase-3剪切位點（A）及化學結構（B）

1.2 穩定表達熒光素酶的ID8細胞株構建ID8細胞用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養液，于5% CO2、37℃恒溫培養箱中培養。將穩定傳代培養的ID8細胞以3×104個/mL的密度接種于6孔板，每孔接種體積為2 mL，使其細胞密度次日能達到30%，以備慢病毒感染。按感染復數（MOI）為50的比例用帶嘌呤霉素抗性luciferase過表達的慢病毒感染ID8細胞，將感染基更換為1 mL含感染增強試劑HitransG A的培養基。感染72 h后，用濃度為4 μg/mL的嘌呤霉素篩選48 h，當細胞熒光密度達到80%時，將嘌呤霉素濃度至少降低至 2 μg/mL。收集細胞，經qPCR鑒定luciferase的表達情況，將轉染成功的細胞凍存。

1.3 qPCR檢測ID8-luc細胞中luciferase表達情況用TRIzol提取細胞RNA，用TaKaRa反轉錄試劑盒進行反轉錄。PCR引物由吉凱基因設計，以GAPDH為內參，引物序列見表1。PCR擴增條件：95℃預變性15 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s重復40個循環。采用公式F＝2－ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.4 小鼠分組及處理將20只6～7周齡雌性C57BL/6小鼠（健康組），隨機分為對照組、順鉑組、GSDME抑制劑組和順鉑+GSDME抑制劑組，每亞組5只。以分組當天為實驗第0天，兩順鉑亞組小鼠于實驗第0天、第14天分別腹腔注射順鉑（10 mg/kg）1次；兩GSDME抑制劑亞組小鼠于實驗第0天開始連續腹腔注射Z-DMLD-FMK（每只200 μg/d），注射18 d；對照組連續注射0.9%氯化鈉液，注射18 d。實驗第19天處死小鼠。

將另20只6～7周齡雌性C57BL/6小鼠（卵巢癌組）隨機分為上述4個亞組。實驗第0天對所有小鼠腹腔注射3×106個ID8-luc細胞［14］。兩順鉑亞組小鼠于第15天、第29天分別腹腔注射順鉑（10 mg/kg）1次；兩GSDME抑制劑亞組小鼠于實驗第15天開始連續腹腔注射Z-DMLD-FMK （每只200 μg/d），共18 d；對照組連續注射0.9%氯化鈉液，注射18 d。實驗第34天處死小鼠。動態監測并記錄兩組小鼠的體質量。

1.5 卵巢癌小鼠活體熒光成像將卵巢癌小鼠在處死前進行活體熒光成像。每只小鼠腹腔注射 150 μL熒光素酶底物D-熒光素鉀鹽（15 g/L）， 10 min后用異氟烷將其麻醉，利用活體熒光成像儀記錄小鼠卵巢癌的成瘤情況，獲得每只小鼠腹腔腫瘤的熒光值。

1.6 小鼠腸道組織取材及病理分析將小鼠以3%戊巴比妥（80 mL/kg）腹腔注射麻醉后，頸椎脫臼處死，取完整的小鼠小腸組織。剪取部分小腸組織用液氮速凍后－80℃保存；部分固定于4%多聚甲醛。

小鼠腸道組織經甲醛固定過夜后，進行脫水、石蠟包埋切片，常規蘇木精-伊紅（H-E）染色，在光鏡下觀察小鼠腸道組織損傷程度，并拍照。取小鼠組織切片，在100倍視野下隨機觀察5個絨毛和5個隱窩結構，用ImageJ軟件測量小鼠腸道絨毛長度及隱窩深度，并計算二者的比值（V/C）。

1.7 Western印跡檢測小鼠腸道中GSDME的表達采用RIPA提取小鼠腸道組織蛋白，取約20 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法轉膜、封閉后加入GSDME一抗（1∶1 000）及內參β-actin一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；加入二抗、洗膜，利用ECL工作液進行曝光。用ImageJ軟件進行圖像分析。

1.8 統計學處理采用GraphPad Prism 9.0進行統計學數據分析，結果以±s表示。組內比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用Tukey檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 穩定表達熒光素酶的ID8細胞株驗證將凍存的ID8-luc細胞復蘇后在顯微鏡下觀察，發現細胞無污染，生長狀態良好且存活率高（圖2A）。與對照組相比，轉染細胞中luciferase基因表達增加（P＜0.000 1，圖2B），表明ID8-luc穩定細胞株構建成功。

圖2 穩定表達熒光素酶的ID8細胞及luciferase基因檢測

2.2 GSDME抑制劑對順鉑誘導的小鼠體質量改變的影響結果（表2）表明：在健康組中，順鉑組小鼠第19天體質量明顯低于對照組（P＜ 0.001）；GSDME抑制劑組小鼠體質量與對照組差異無統計學意義；順鉑＋GSDME抑制劑組小鼠體質量較順鉑組明顯增加（P＜0.05）。在卵巢癌組中，順鉑組小鼠第34天平均體質量明顯低于對照組（P＜0.001）；GSDME抑制劑組小鼠體質量與對照組差異無統計學意義；順鉑＋GSDME抑制劑組小鼠體質量較順鉑組明顯增加（P＜0.001）。

表2 各組小鼠處理前后體質量變化n＝5， g

2.3 GSDME抑制劑對順鉑抗卵巢癌作用的影響結果（圖3）表明：在卵巢癌組中，與對照組相比，順鉑組小鼠卵巢腫瘤負荷明顯減小（P＜ 0.05），GSDME抑制劑組小鼠腫瘤負荷無明顯改變；與順鉑組相比，順鉑＋GSDME抑制劑組小鼠腫瘤負荷無明顯改變。

圖3 GSDME抑制劑對卵巢癌腫瘤負荷的影響

2.4 小鼠腸道損傷結果（圖4）表明：在健康組中，與對照組相比，順鉑組小鼠腸道明顯萎縮、隱窩結構被破壞、腸壁變薄、腸絨毛形態不規則，絨毛長度及V/C值減小（P＜0.000 1）；與對照組相比，GSDME抑制劑組腸道組織無明顯改變；與順鉑組相比，順鉑＋GSDME抑制劑組小鼠腸道損傷減輕，絨毛長度及V/C值增加（P＜0.05）。

圖4 GSDME抑制劑對順鉑誘導的小鼠腸道損傷的影響

在卵巢癌組中，與對照組相比，順鉑組小鼠腸道明顯萎縮、腸壁變薄、結構被破壞，腸道絨毛長度及V/C值減?。≒＜0.000 1）；與對照組相比，GSDME抑制劑組小鼠腸道組織、絨毛長度和V/C值無明顯變化；與順鉑組相比，順鉑＋GSDME抑制劑組小鼠腸道損傷減輕，絨毛長度及V/C值增加（P＜0.000 1）。

2.5 GSDME抑制劑對順鉑誘導小鼠腸道組織GSDME表達的影響結果（圖5）表明：與對照組相比，順鉑組小鼠腸道組織中GSDME蛋白表達增加（P＜0.001）；與順鉑組相比，順鉑＋GSDME抑制劑組小鼠腸道組織中GSDME表達降低（P＜0.05）。

圖5 小鼠腸道組織中GSDME蛋白表達情況

3 討 論

近年來，隨著細胞焦亡相關研究的深入，發現其與腫瘤、炎癥損傷、代謝性疾病及免疫性疾病相關［15-17］。不同于細胞凋亡，細胞焦亡是伴隨著細胞內容物和一系列炎癥因子級聯式釋放的細胞程序性死亡方式。而GSDME是細胞焦亡的關鍵執行分子，其鉸鏈區有一段caspase-3的四肽切割位點“DMPD”?；熕幬?、腫瘤壞死因子（TNF-α）或病毒感染后可以通過激活caspase-3而高效切割GSDME，形成具有磷脂親和力的GSDME-N端蛋白，并轉移至細胞膜寡聚打孔，引起細胞脹大、胞膜破裂、釋放其內容物及乳酸脫氫酶（LDH）［7，18］。通過多種細胞系與組織發現，GSDME在人體正常組織中廣泛高表達，尤其是胎盤、心臟、腎臟、腸道及耳蝸組織中，而在腫瘤細胞中由于過度甲基化而呈低表達［9］。化療藥物可以誘導高表達GSDME的細胞發生焦亡，而誘導低表達GSDME的細胞發生凋亡。GSDME的活化水平決定了caspase-3激活后的細胞是焦亡還是凋亡。既往研究［7，19］證實，GSDME活化是化療藥物引起不良反應的重要原因。

因此，通過調控 GSDME 的表達水平治療腫瘤主要體現在以下兩個方面：（1）提高腫瘤組織中GSDME的表達水平，從而增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用；（2）通過降低正常組織中GSDME的表達水平或通過應用GSDME特異性抑制劑，減輕或避免化療過程中正常組織受到的損傷。本研究聚焦于后者，即通過在小鼠卵巢癌模型中應用GSDME抑制劑，探索其能否改善化療相關腸道不良反應。

GSDME在正常組織中，尤其是腸道組織中表達水平高，這可能是化療相關不良反應最常發生于腸道的原因。本研究進一步證實，順鉑明顯引起小鼠腸道損傷、體質量下降，并增加小鼠腸道組織中GSDME的表達；而且，在健康和卵巢癌移植瘤模型小鼠中，GSDME抑制劑均可緩解順鉑誘導的小鼠消化道損傷和體質量下降，提示化療藥物誘導的消化道損傷可能與高表達GSDME的細胞發生焦亡相關。而GSDME在腫瘤細胞中表達量很低，因此GSDME抑制劑不影響化療效果。本研究通過活體熒光成像證實，GSDME抑制劑對小鼠卵巢癌負荷無影響，即GSDME抑制劑不影響順鉑的抗腫瘤 作用。

綜上所述，化療藥物能通過激活caspase-3/GSDME介導細胞焦亡，導致化療相關不良反應。本研究在健康和卵巢癌小鼠模型中證實，GSDME抑制劑能減輕順鉑誘導的腸道損傷，其可能通過競爭性抑制caspase-3對GSDME的剪切作用，阻斷細胞焦亡通路而發揮作用。這一結果可為臨床上治療卵巢癌化療誘導的消化道損傷提供新的思路與方向。后續研究將通過特異性敲除腸道GSDME基因，構建GSDME－/－小鼠，進一步探討順鉑引起的消化道損傷與GSDME介導的細胞焦亡的關系。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。