靶向CD147納米微泡的制備及超聲成像能力檢測

袁海霞，關佩珊，金赟杰，楊 萍，吳愛琴，王文平，3*

1. 復旦大學附屬中山醫院廈門醫院超聲科，廈門 361015

2. 復旦大學附屬中山醫院超聲科，上海 200032

3. 復旦大學超聲醫學與工程研究所，上海 200032

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 是一種富血管實體瘤，發病率居全球惡性腫瘤第5位，相關死亡率居第3位［1］。近年來，納米級微泡超聲造影劑在HCC診療中的應用越來越受到關注。納米級微泡進入機體后可逃脫機體網狀內皮系統的清除，在體內循環時間長，并可穿透腫瘤血管屏障，通過滲透與滯留增強效應（enhanced permeability and retention effect， EPR）在腫瘤組織間隙內蓄積，不再局限于血池顯像［2］。而結合特定抗體或配體的靶向納米微泡造影劑，在腫瘤等疾病的早期診斷及靶向治療方面具有更廣闊的應用前景。CD147屬于免疫球蛋白家族，是一種跨膜糖蛋白，在HCC細胞高度表達并與HCC進展和預后密切相關［3］。本研究擬制備一種靶向CD147的納米級微泡造影劑，并檢測其理化性質、超聲成像能力，以及其與HCC細胞特異性結合的能力，以期為臨床HCC診療監測提供一種納米級超聲分子探針。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料全氟丙烷購自上海上氟科技有限公司，香豆素-6購自比迪生物科技（上海）有限公司，聚乙烯醇（PVA，分子量3 000）購自Sigma 公司，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基（DSPE-PEG2000-COOH）購自上海士宇生物技術有限公司；卵磷脂購自Alfa Aesar公司；聚乳酸-羥基乙酸-聚乙二醇共聚物（PLGA-PEG）購自上海舜納生物科技有限公司；CD147抗體購自神州細胞生物科技有限公司。

1.2 儀器設備Mastersizer 3000激光粒度儀購自英國馬爾文公司；SB20001電子天平購自上海滬粵明科學儀器有限公司，超聲破碎儀購自寧波洛尚智能科技有限公司；TGL20MW臺式離心機購自湖南赫西儀器裝備有限公司；JEOL2010透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社；攪拌器購自上海豫康科教儀器設備有限公司。

1.3 制 備 方 法將30 mg PLGA-PEG、15 mg DSPE-PEG2000-COOH溶解于含1.5 mL二氯甲烷的三頸瓶中，加入150 μL全氟丙烷飽和水溶液，于100 W超聲破碎儀中冰浴乳化5 min，通入全氟丙烷氣體，加入5 mL 3%聚乙烯醇再次超聲乳化5 min。二次乳化懸液中再次加入20 mL全氟丙烷飽和1%聚乙烯醇溶液，400r/min攪拌過夜；11 180×g離心10 min，去除聚乙烯醇，制得全氟丙烷超聲納米微泡。將納米微泡以嗎啉乙磺酸（MES）緩沖溶液（pH＝5）透析過夜，加入EDC 孵育 2 h以活化表面羧基；調整溶液pH至7.0，加入0.1 mg CD147抗體（偶聯反應）過夜。以Sephadex G25凝膠層析柱分離去除游離抗體，獲得靶向CD147超聲納米微泡，濃縮至5×108個/mL，分裝于5 mL西林瓶中（每瓶2 mL），充入全氟丙烷氣體4℃密閉保存。

1.4 理化性質檢測檢測納米微泡粒徑電位表征：納米微泡制備后1 d及3 d時，用適量純水稀釋，通過激光粒度儀檢測溶液中靶向納米囊泡及未修飾納米囊泡的粒徑、電位及多分散系數。

1.5 靶向MHCC-97H細胞能力檢測取對數生長期的MHCC-97H細胞，消化計數，以每孔2×104個細胞鋪于共聚焦培養皿，過夜。次日，在孔中加入50 μL香豆素6熒光標記的靶向及非靶向超聲微泡，并設置0.9%氯化鈉液陰性對照。處理后的細胞繼續培養4 h，以PBS洗滌2次后，用4%甲醛溶液室溫固定20 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，DAPI染色15 min，PBS洗滌2次。最后，每孔加入PBS，通過共聚焦顯微鏡拍攝，ImageJ軟件分析微泡/核熒光強度比值。

1.6 超聲成像能力檢測備用納米微泡用PBS稀釋（1∶100），注入專用瓊脂模具中。采用Canon Aplio i500超聲儀，14L5探頭，將超聲探頭置于微泡溶液表面，檢測微泡超聲成像能力。用裸鼠制作MHCC-97H皮下移植瘤模型，經裸鼠尾靜脈注射按1∶10稀釋的納米微泡50 μL，啟動超聲造影模式，機械指數（MI）設為0.1，焦點設置于腫瘤稍下方，觀察腫瘤成像效果。

1.7 統計學處理采用 SPSS 23.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 微泡理化性質結果（表1）顯示：制備完成的微泡溶液在全氟丙烷氣體中4℃密閉保存后 1 d及3 d，粒徑大小均一，電位及聚合物分散性指數（PDI）未見明顯變化。

表1 靶向與非靶向CD147納米微泡理化性質比較

2.2 靶向CD147納米微泡的細胞水平尋靶能力共聚焦顯微鏡下觀察（圖1）發現：靶向微泡較非靶向納米微泡能更高效地與MHCC-97H細胞結合（微泡/核熒光強度比值：1.18±0.36vs0.15±0.04，P＜0.01）。

圖1 共聚焦顯微鏡下觀察納米微泡靶向MHCC-97H的能力

2.3 納米微泡體外超聲成像超聲成像（圖2）顯示：靶向與非靶向納米微泡制備后1、3 d均勻分布于用PBS溶液中。

圖2 納米微泡體外超聲成像圖

2.4 靶向CD147微泡裸鼠皮下移植瘤內超聲造影成像超聲造影（圖3）顯示：靶向與非靶向納米微泡制備后1、3 d，在裸鼠移植瘤模型體內均有較好的超聲成像效果。

圖3 納米微泡注射于裸鼠MHCC-97H皮下移植瘤模型后超聲造影（左側）及基波超聲成像（右側）

3 討 論

靶向納米微泡通過將納米微泡與多肽或抗體偶聯，進而能與癌細胞表面過表達的生物標志物緊密結合，實現分子成像。其顯像功能較傳統超聲造影技術特異度和靈敏度更高，使活體組織或病灶細胞的抗原表位可視化并有助于定量分析，有利于臨床實施針對性治療及療效評估，且臨床風險小［4-5］。

CD147在腫瘤病理免疫組化檢查中陽性率很高，達75%。CD147在腫瘤組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織［6］。HAb18G/CD147 是從HCC細胞cDNA庫中篩選出來的一種抗原，其編碼序列與 CD147相似，是CD147家族的新成員［7］。HAb18G/CD147 廣泛表達于多種HCC細胞系，但不表達于LO2人類正常肝細胞系，且表達于74.0%（37/50）HCC患者的腫瘤細胞膜［8］。CD147可反映HCC細胞的生長，誘導基質金屬蛋白酶的分泌，促進HCC細胞的侵襲及轉移，同時參與HCC血管生長和耐藥性形成過程［3］。目前，有關靶向CD147的納米微泡超聲造影劑用于腫瘤的報道較少。Liu等［9］制備了一種靶向CD147的納米微泡；體外實驗發現，該納米微泡只與HCC細胞結合而不與正常肝細胞結合，本研究細胞實驗也發現靶向CD147微泡能特異性結合于HCC細胞表面；在裸鼠體內實驗中，靶向納米微泡也獲得了較好的超聲成像效果。后續研究將結合超聲定量參數分析靶向與非靶向微泡的成像差異。

微泡的粒徑、電位的穩定性、超聲成像能力決定其是否可作為合格的分子探針應用于超聲分子顯像及靶向治療。本研究研制的靶向CD147微泡理化性質穩定，在4℃及充滿全氟丙烷的密閉環境中保存1 d及3 d后，其物理性質均未明顯變化，與李翠仙等［10］制備的超聲微泡類似，且在體外及裸鼠體內均表現良好的超聲成像能力。

綜上所述，本研究制備了一種通過靶向CD147特異結合于HCC細胞的納米微泡，該微泡大小、分布均勻，穩定性好，在體外及裸鼠體內均有良好的超聲成像能力，保存3 d后性能仍穩定，是一種較為理想的超聲分子造影劑，為HCC分子顯像及治療提供了新方向。后續通過分析其不同時間點的超聲成像灰度值，有利于腫瘤超聲定量 分析。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。