礦泉水中銅綠假單胞菌能力驗證結果分析與討論

◎ 胡同靜，劉艷容，劉 敏，嚴 婷

（1.江蘇蘇測檢測認證有限公司，江蘇 南京 210019；2.南京市產品質量監督檢驗院，江蘇 南京 210019）

為了保證日常飲用水的質量安全，有關部門通過如《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）等國家標準對礦泉水中可能存在銅綠假單胞菌的檢測限值提供了規范[1]。有關部門在市面上發現礦泉水可能存在銅綠假單胞菌污染風險時，應督促生產廠家立即停止銷售。生產廠家也必須要嚴格控制生產過程中的各道生產工序，防止水污染，確保飲用水安全[2]。為了測試實驗室對于飲用天然礦泉水的微生物檢測能力、考核技術人員工作水平、提高實驗室檢測水平、增強實驗室競爭力，實驗室參加了本次能力驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養基：CN瓊脂平板、金氏B培養基、綠膿菌素測定培養基，均采購自北京陸橋微生物制劑有限公司，配制后使用；乙酰胺肉湯、氧化酶試劑，均采購自北京陸橋微生物制劑有限公司，直接使用成品。

標準菌株：按照國標要求，試驗中使用銅綠假單胞菌ATCC27853作為陽性對照，熒光假單胞菌ATCC13525作為陰性對照。

1.2 儀器與設備

微孔濾膜過濾器及配套一次性無菌塑料濾杯；微生物培養箱；365 nm紫外分析儀；VITEK全自動微生物檢測系統。

1.3 試驗方法

本次試驗中的所有操作應在100級或以上的潔凈工作臺進行，尤其是過濾操作。

1.3.1 樣品處理

將固體樣品用520 mL無菌水再水化，制成受試物原液待用。

1.3.2 樣品稀釋

取30 mL受試物原液，加入270 mL無菌水做10倍梯度稀釋，即為受試物10-1稀釋液。依次再取30 mL受試物10-1稀釋液加入270 mL無菌水制成受試物10-2稀釋液，取30 mL受試物10-2稀釋液加入270 mL無菌水制成受試物10-3稀釋液待用。

1.3.3 樣品過濾

（1）安裝無菌濾膜、濾杯。用無菌水將0.45 μm濾膜潤濕，取無菌鑷子夾取濾膜平鋪于微孔濾膜過濾器的濾頭，完全貼合不留縫隙。將一次性塑料濾杯安裝于微孔濾膜過濾器上。

（2）取樣。將受試物原液和各梯度稀釋液分別加入微孔濾膜過濾器的濾杯中至250 mL刻度線，啟動微孔濾膜過濾裝置。待其過濾結束后，用無菌鑷子將過濾后的濾膜轉移平鋪于CN瓊脂平板上。將平板倒置，于（36±1）℃培養24～48 h，觀察濾膜上菌落的生長情況并計數。

（3）挑取典型菌落通過氧化酶試驗、金氏B培養基、綠膿菌素試驗、乙酰胺肉湯進行后續驗證。最終的銅綠假單胞菌菌落計數按公式進行計數。

1.3.4 確定性試驗

（1）營養瓊脂。將受試物經濾膜過濾后于（36±1）℃培養20～24 h，選取需要驗證的可疑菌落通過劃線的方式接種到營養瓊脂培養基，于（36±1）℃培養20～24 h進行純化。檢查再次純化后的菌落，并對最初顯紅褐色的菌落進行氧化酶試驗驗證。

（2）氧化酶試驗。取2～3滴新配制的氧化酶試劑滴到置于平皿里的潔凈濾紙上，用接種環或玻璃棒將適量的營養瓊脂中疑似菌落純種培養物涂布在預備好的濾紙上，在10 s內顯深藍紫色的記錄為陽性。如果使用氧化酶試紙一類的測試產品可按照使用說明書進行本項測試。

（3）金氏B培養基。將上述菌落呈紅褐色且氧化酶試驗結果呈陽性的培養物接種于金氏B培養基上，于（36±1）℃培養24 h～5 d（視情況而定）。需每天取出在365 nm波長的紫外燈下檢查其是否產生熒光性，將5 d內產生熒光的菌落記錄為陽性。

（4）綠膿菌素試驗。取可疑菌落2～3個，分別接種在綠膿菌素測定培養基上，于（36±1）℃培養（24±2）h，加入三氯甲烷3～5 mL，充分振蕩培養基使培養物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內，待三氯甲烷提取液呈藍色時，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中并加入1 mol·L-1的鹽酸1 mL左右，振蕩后靜置片刻。若上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時表示受試物中有綠膿菌素存在，記錄為陽性。該實驗過程中三氯甲烷為有機溶劑，移取過程中應在通風櫥內進行，注意不要沾至皮膚上。

（5）乙酰胺液體培養基。將純種培養物接種到裝有乙酰胺液體培養基的若干試管中，于（36±1）℃培養20～24 h。然后向每支試管受試物中分別加入1～2滴鈉氏試劑后檢查產氨情況，若出現從深黃色到磚紅色的明顯顏色變化則記錄為陽性，如沒有變化則記為陰性。

（6）在國標要求的相關驗證試驗之外，可以對疑似菌落提取物進行VITEK全自動微生物檢測系統分析作為補充驗證，以確定是否為銅綠假單胞菌。

1.3.5 計數方法

將產生綠膿色（藍色/綠色）或氧化酶反應呈陽性、在365 nm波長紫外燈下產生熒光，且在乙酰胺肉湯中產氨的所有菌落證實為銅綠假單胞菌，對其進行計數。通過計數培養后濾膜上的菌落以獲得銅綠假單胞菌的數量，其他呈紅褐色的菌落視情況進行進一步驗證。

濾膜上的特征菌落可證實為銅綠假單胞菌的菌落。計算菌落數時應考慮到驗證試驗的比例及特定的水量，過濾的水樣的體積應為250 mL。菌落計數按式（1）計算：

式中：P為呈藍/綠色的菌落數；F為顯熒光的菌落數；cF為產氨陽性的顯熒光菌落數；nF為進行產氨測試的顯熒光菌落數；R為呈紅褐色的菌落數；cR為產氨、氧化酶、金氏B培養基上顯熒光測試均呈陽性的紅褐色菌落數；nR為進行產氨、氧化酶、金氏B培養基上顯熒光測試的紅褐色菌落數。

根據藍色或綠色菌落的計數和確證性試驗的結果，計算每250 mL水樣中的銅綠假單胞菌數量，結果以CFU/250 mL計算。在整個實驗過程中應注意生物安全防護，避免樣品間交叉污染；實驗結束后應盡快對所有受試物進行無害化處理，避免污染環境[3-5]

2 結果與分析

由表1、表2可知，實驗室對樣品21-M873的鑒定結果為銅綠假單胞菌陽性，計數結果為8.7×103CFU/250 mL；樣品21-Q877的鑒定結果為銅綠假單胞菌陽性，計數結果為3.8×103CFU/250 mL。

表1 樣品21-M873菌落計數表

表2 樣品21-Q877菌落計數表

3 結論

本次能力驗證實驗對所有疑似菌落都進行了完整的基礎性驗證和VITEK分析。通過試驗結果是否一致，評估實驗人員的實驗準備、實驗操作、實驗結果計數等方面的能力。通過本次能力驗證既考核了技術人員的工作水平，又提高了實驗室檢測水平，增強實驗室外部競爭力，為實驗室迎接CNAS檢查積累經驗，也是實驗室內部質量的有效補充。本次能力驗證活動取得了滿意的結果，達到了實驗室內部質控、人員考核、水平驗證的預期目的，為日常檢測工作積累了寶貴的經驗。